人們很早就發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織內(nèi)及其周圍存在著大量T/NK細(xì)胞。與機(jī)體其他部位相比，腫瘤及其周圍組織中的T/NK細(xì)胞功能顯著降低［1］。當(dāng)今，常以T/NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以IL-2為刺激劑作為腫瘤的過(guò)繼性免疫治療的手段，但對(duì)大部分病人療效不佳，其原因是腫瘤及其周圍組織內(nèi)也存在大量富含單核/巨噬細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞 (Mo)。 Mo 對(duì)荷瘤動(dòng)物淋巴細(xì)胞抗腫瘤作用有抑制效應(yīng)，這種抑制作用與Mo分泌反應(yīng)性氧代謝物（reactive oxygen metabolites，ROM）密切相關(guān)［2］。二氫氯化物組胺（簡(jiǎn)稱組胺）可以逆轉(zhuǎn)ROM對(duì)T/NK抗腫瘤活性抑制作用，并且已做II期臨床試驗(yàn)，效果明顯［1］，但其毒副作用大，臨床難于應(yīng)用。為了尋求高效低毒、便于臨床應(yīng)用的ROM逆轉(zhuǎn)劑，我們進(jìn)行了還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）在體外白血病細(xì)胞株培養(yǎng)體系中逆轉(zhuǎn)ROM、增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

　　材料和方法

　　材料

　　K562細(xì)胞株由福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院老年病研究所朱元貴博士惠贈(zèng)，新鮮健康人單的采白細(xì)胞由泉州市中心血站提供，IL-2為北京雙鷺?biāo)帢I(yè)公司產(chǎn)品，二氫氯化物組胺、GSH和MTT均為Sigma公司產(chǎn)品，CD3、CD56免疫組織化學(xué)試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品，活性氧測(cè)試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品。

　　方法

　　富含NK細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞（E）的分離 采用Percoll不連續(xù)密度梯度分離法［2］分離，采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行鑒定［3］，其純度達(dá)30%，活存率≥95%。

　　富含單核細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞（Mo)的分離 采用Colotta方法［2］分離并作非特異性酯酶染色鑒定純度，4℃冷藏備用，其純度為70%，活存率≥95%。

　　細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)

　　將富含NK細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞(E)、K562細(xì)胞(T)按E/T比10∶1、10∶5、10∶10 3個(gè)比例加入相應(yīng)的96孔培養(yǎng)板中（NK細(xì)胞為105/孔），腫瘤組織中淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞的比例在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，我們觀察30份惡性腫瘤的病理切片及慢性髓細(xì)胞白血病的骨髓涂片，其比例多數(shù)在10∶1至10∶3，少數(shù)高達(dá)10∶10，因此，在E/T為10∶1的比例孔中按E/Mo細(xì)胞為10∶2、10∶5、10∶10比例添加單核細(xì)胞，以僅加K562細(xì)胞、NK細(xì)胞、Mo、NK細(xì)胞+Mo、Mo+K562細(xì)胞及不加任何細(xì)胞的全空白作為對(duì)照，混合培養(yǎng)6小時(shí)檢測(cè)ROM產(chǎn)量，同時(shí)在24小時(shí)用MTT法［4］檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率(K562 cell inhibition rate，KIR)，計(jì)算公式為KIR=（1-ODE/T-DDE/ODT）×100%。每組每種檢測(cè)各作3個(gè)復(fù)孔，觀察ROM產(chǎn)量與KIR、NK細(xì)胞數(shù)量、Mo數(shù)量之間的關(guān)系。

　　GSH作用的測(cè)定

　　以二氫氯化物組胺為陽(yáng)性對(duì)照，以K562+NK+Mo+IL-2為空白對(duì)照，檢測(cè)GSH逆轉(zhuǎn)ROM及提高K562細(xì)胞抑制率的作用。按上述細(xì)胞比例先分別入NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、IL-2（150 U/ml） (方法根據(jù)文獻(xiàn)[5］ )，同時(shí)在各個(gè)比例孔中分別加組胺（10、20和50 umol/L 3種濃度），GSH（25、50、100和250 μmol/L 4種濃度），在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下共培養(yǎng)24小時(shí)后加入K562細(xì)胞（按E/T比為10/1），再培養(yǎng)6小時(shí)及24小時(shí)，檢測(cè)ROM產(chǎn)量，同時(shí)用MTT法檢測(cè)K562細(xì)胞抑制率，KIR=（1-ODE/T-ODE/ODT）×100%；同樣每組每種檢測(cè)各做3個(gè)復(fù)孔［4］。

　　ROM檢測(cè)

　　采用紫外分光光度比色法、按南京建成活性氧測(cè)試盒說(shuō)明操作，檢測(cè)活性氧的產(chǎn)量。

　　K562細(xì)胞抑制率 采用MTT法檢測(cè)（公式見(jiàn)上）。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料結(jié)果以x±SD表示，多組均數(shù)比較采用廣義線性模型（general linear model），各實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett T3檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)），雙變量相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05 作為差異顯著性檢驗(yàn)水平。

　　結(jié) 果

　　GSH對(duì)ROM產(chǎn)量及NK細(xì)胞抑制K562的影響

　　當(dāng)E/Mo=10/2時(shí)，各種濃度GSH和組胺均可明顯降低ROM產(chǎn)量，提高K562細(xì)胞抑制率（P<0.05），逆轉(zhuǎn)ROM作用GSH強(qiáng)于組胺；當(dāng)E/Mo=10/5時(shí)，各濃度組胺和高濃度GSH可減少ROM產(chǎn)量（P<0.05），但不能提高K562細(xì)胞抑制率；當(dāng)E/Mo=10/10，僅高濃度的組胺和高濃度GSH可減少ROM產(chǎn)量（P<0.05），各種濃度的組胺和GSH均不能提高K562細(xì)胞抑制率（P>0.05）（ 

    NK細(xì)胞、Mo、IL-2對(duì)ROM產(chǎn)量和K562細(xì)胞抑制率的影響

　　結(jié)果顯示：K562細(xì)胞加入NK細(xì)胞后，ROM產(chǎn)量減少（P<0.05），K562細(xì)胞抑制率達(dá)65.50%，而加入Mo后ROM產(chǎn)量明顯增加，且Mo濃度越高，ROM產(chǎn)量越多，呈量效關(guān)系（P<0.05），但K562細(xì)胞不被抑制（P>0.05）；加入激活劑IL-2后，K562細(xì)胞+NK細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中ROM產(chǎn)量明顯增多（P<0.05），K562細(xì)胞的抑制率明顯提高（P<0.05）；

　　在K562+NK+IL-2培養(yǎng)體系中加入Mo，ROM產(chǎn)量增多，且Mo濃度越高，ROM產(chǎn)量越多，E/Mo=10/1或E/Mo=10/5，K562細(xì)胞抑制率改變不明顯，當(dāng)E/Mo=10/10時(shí)，K562細(xì)胞抑制率從86.5%降至48.09%（P<0.01）（表2） 。Table 2. Effect of NK cells and/or monocytes on ROM yield and K562 cell inhibiton rate（略）

　　ROM產(chǎn)量與K562細(xì)胞抑制的關(guān)系

　　ROM的產(chǎn)量與K562細(xì)胞的抑制率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.56，P<0.05），ROM產(chǎn)量越高、K562細(xì)胞的抑制率越低。隨著Mo濃度的升高，ROM的產(chǎn)量增多，K562細(xì)胞的抑制率逐降低，且呈量效關(guān)系（P<0.05）。 

    近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤/白血病細(xì)胞內(nèi)GSH/GST-S活性增高使腫瘤/白血病細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性［10，11］，細(xì)胞內(nèi)的GSH增多，降低了化療效果。GSH是腫瘤/白血病多源耐藥的機(jī)制之一，我們得出了與文獻(xiàn)報(bào)道相反的結(jié)果的原因是：文獻(xiàn)報(bào)道GSH影響腫瘤/白血病療效指的是化療療效，因?yàn)樵S多化療藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要通過(guò)產(chǎn)生ROM而發(fā)揮作用，在ROM作用下線粒體還原型巰基轉(zhuǎn)化為氧化型二硫鍵，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mtPTP）開(kāi)放，并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。因此，腫瘤/白血病細(xì)胞內(nèi)GSH增多，化療藥效降低；而在過(guò)繼性免疫治療中，GSH在腫瘤/白血病細(xì)胞外起到逆轉(zhuǎn)Mo產(chǎn)生的ROM，保護(hù)T/NK細(xì)胞免受ROM的損傷，充分發(fā)揮T/NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。

    綜上所述，GSH具有逆轉(zhuǎn)ROM，提高NK對(duì)腫瘤/白血病細(xì)胞的抑制活性，毒副作用輕微，可能成為繼組胺之后更理想抗腫瘤/白血病免疫佐劑，值得進(jìn)一步研究。

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