替莫唑胺緩釋微球局部植入治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的療效

    目的：研究替莫唑胺緩釋微球（TM—MS)局部植入對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤的治療效果。

    方法：將C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于鼠腦左側(cè)尾狀核，制備大鼠腦膠質(zhì)瘤模型。分別用替莫唑胺口服及TM—MS腫瘤局部植入治療，觀察大鼠的一般情況、生存期、腫瘤體積大小、病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原蛋白的表達(dá)；TUNEL法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞的凋亡。

    結(jié)果：TM—MS治療大鼠的生存期較假手術(shù)組、空載體組、替莫唑胺口服組明顯延長(zhǎng)[(31．2±6．21)d vs(20．7±4．83)、(19．2 4-6．23)、(24．7±6．31)d；P<0．05或P<O．01]。MR／檢查顯示經(jīng)TM—MS治療后腦內(nèi)瘤灶體積較假手術(shù)組、空載體組、替莫唑胺口服組明顯縮小[(28．8±6．41)mm vs(56．4 4-6．92)、(58．2 4-5．36)、(46．7 4-7．28)mm ；P<0．05或P<0．01]；TM—MS治療后腫瘤細(xì)胞PCNA表達(dá)率較假手術(shù)組、空載體組、替莫唑胺口服組顯著降低[(20．2 4-4．33)％ us(63．2 4-5．91)％ 、(62．1±7．88)％、(41．7±6．71)％；P<n 01]，細(xì)胞凋亡率也明顯增高[(32．31 4-3．17)％ 伽(8．63 4-1．52)％、(9．25-+2．31)％ 、(16．14 4-3．42)％；P<0．01]。

    結(jié)論：TM．MS局部植入治療大鼠腦膠質(zhì)瘤能顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)大鼠生存期，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中較為常見(jiàn)的一種腫瘤，呈局部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵襲性強(qiáng)，富血運(yùn)，容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。目前惡性膠質(zhì)瘤患者中位生存期仍短于1年�；�療在惡性膠質(zhì)瘤的治療中起到輔助治療作用，但容易出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象。腦瘤局部緩釋藥物間質(zhì)化療有如下優(yōu)勢(shì)：(1)緩釋制劑直接作用于腫瘤部位，避開(kāi)了血腦屏障，增加了腦瘤化療藥物選擇范圍；(2)能提高局部藥物濃度，減少全身毒性作用；(3)膠質(zhì)瘤常為局部復(fù)發(fā)，其90％ 均在原發(fā)腫瘤切除部位外圍的2 cm范圍內(nèi)，這就使其非常適合進(jìn)行局部緩釋化療。

    替莫唑胺(temozolomide，TM)是一種咪唑四嗪類(lèi)藥物，較易透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦組織，是目前較好的治療腦膠質(zhì)瘤藥物。但是目前臨床應(yīng)用只有口服劑型。第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院以乳酸一羥基乙酸共聚物[poly(1actide-CO-glycolide)，PLGA]為載體，制備了可供腦部植入用的替莫唑胺緩釋微球（TM—MS)制劑，體外實(shí)驗(yàn)顯示該緩釋微球能緩慢釋放12 h，與單純替莫唑胺相比，替莫唑胺緩釋微球有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性 。本研究以TM-MS局部植入治療大鼠惡性膠質(zhì)瘤，希望能獲得較好的療效。

    1 材料與方法

    1．1 材料

    C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所提供。替莫唑胺原藥購(gòu)自北京萊瑞森醫(yī)藥科技有限公司，替莫唑胺緩釋微球由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室研制和提供。細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。PCNA兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司，ABC免疫組化試劑盒及抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。主要儀器：江灣Ⅱ型腦立體定向儀購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)，磁共振儀購(gòu)自德國(guó)Siemens公司。雄性SD大鼠，體重200～300 g，共80只，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2007-0003。

    1．2 SD大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型的建立

    C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞以含10％小牛血清的DMEM液培養(yǎng)。根據(jù)Barker法確定切口和鉆孔位置，在大鼠腦立體定位儀上選取大鼠腦左側(cè)尾狀核區(qū)為靶點(diǎn)，其坐標(biāo)為：前囟中點(diǎn)后1．0 mm，矢狀縫右旁開(kāi)3．5 mm，硬膜下5．0 mm。立體定向植入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)C6腫瘤細(xì)胞2×10。個(gè)。術(shù)后5 d內(nèi)每只大鼠每天給予青霉素10萬(wàn)U腹腔注射。術(shù)后第5天行頭顱MRI增強(qiáng)掃描，證明大鼠顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，確證模型建立成功。該模型在接種后3 d有腫瘤形成，5 d后腫瘤直徑約為3 mm，并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)期，治療時(shí)機(jī)以5～14 d為宜 。

    1．3 動(dòng)物分組與治療

    接種c6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后觀察大鼠活動(dòng)，6 d后將80只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。分組具體如下：(1)假手術(shù)組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)。(2)空載體植入組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 ITIB3)后，植入空白緩釋微球16 n1g。(3)口服替莫唑胺(TM)組：切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)，口服替莫唑胺50 mg／kg，連服5 d。(4)替莫唑胺微球(TM-MS)植入組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)后，植入替莫唑胺緩釋微球16 mg(含替莫唑胺1 mg)。分組后各組進(jìn)行相應(yīng)治療，治療14 d后參照文獻(xiàn)[16]方法，行冠狀面和矢狀面T1WI平掃及增強(qiáng)掃描，掃描后各組處死10只，剩余10只用于觀察生存期。

    1．4 MRI成像及檢測(cè)方法

    在各組治療14 d時(shí)行冠狀面和矢狀面T1WI平掃及增強(qiáng)掃描。腫瘤體積計(jì)算：根據(jù)強(qiáng)化影像在冠狀掃描最大腫瘤平面測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑( )及寬徑( )，在矢狀掃描最大腫瘤平面測(cè)量高徑(H)，代入公式：V=(4／3×仃×L×W×日)×1／8。

    1．5 C6膠質(zhì)瘤的病理學(xué)觀察

    各組動(dòng)物在處死時(shí)行標(biāo)本灌注，甲醛溶液固定16～24 h后進(jìn)行石蠟包埋，隨后對(duì)各組腫瘤組織蠟塊行層厚8 m切片，梯度酒精脫蠟至水，H．E染色，光鏡下病理觀察腫瘤組織。

    1．6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)C6膠質(zhì)瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原蛋白的表達(dá)

    腫瘤石蠟切片脫蠟后，均經(jīng)0．1 mol／L PBS沖洗2～3 h，3％ H O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，正常山羊血清封閉25 min，晾干不洗。加入增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)單抗，37℃1 h過(guò)夜。用鏈霉親和素-生物素一過(guò)氧化氫酶復(fù)合物法(streptavidin—biotin complex，SABC)顯色，根據(jù)組織切片顯色情況確定終止時(shí)問(wèn)，一般為5 ～ 10 m i n 。同時(shí)作陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在高倍(4 0 0 倍) 視野下分別計(jì)數(shù)P C N A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算P C N A 陽(yáng)性率。P C N A 陽(yáng)性率( ％ ) = 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)× 10 0 ％ 。

    1．7 T U N E L 法檢測(cè)鼠C 6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡

按照試劑盒說(shuō)明步驟操作。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水， 蛋白酶K 消化、T U N E L 反應(yīng)混合溶液標(biāo)記，D A B 底物反應(yīng)， 蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微鏡下分析結(jié)果：隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野( > 1000個(gè)細(xì)胞) ，在光鏡下分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，凋亡率( ％ ) = 凋亡細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)X 100 ％ 。

    1．8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x ± S 表示， 采用S A S 9．1．3 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行K a p l a n ． M e i e r 生存分析及方差分析。P < 0 ． 0 5 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2．1 T M — M S 治療腦膠質(zhì)瘤大鼠的一般療效

    假手術(shù)組和空載體組大鼠活動(dòng)量明顯減少， 食物和水的消耗量降低，皮毛失去光澤， 有不同程度的腹瀉；接種2 周時(shí)大多出現(xiàn)明顯的顱內(nèi)高壓癥狀，表現(xiàn)為偏癱，眼周淤血；接種后第3 周時(shí)開(kāi)始發(fā)生死亡， 至第4 周時(shí)全部死亡。假手術(shù)組和空載體組大鼠平均生存期分別為( 2 0 ． 4 ± 4 ． 8 3 ) d 和( 1 9 ． 6 ±6 ． 2 3 ) d ；給藥T M 后大鼠生存狀態(tài)稍有改善，皮毛枯燥， 較萎靡，接種后1 7 d 時(shí)開(kāi)始發(fā)生死亡， 至第3 6天時(shí)全部死亡， 平均生存期為( 2 4 ． 5 ± 6 ． 3 0 ) d ；給藥T M ． M S 后大鼠生存狀態(tài)明顯改善， 皮毛較光鮮， 僅有輕度萎靡， 平均生存期為( 3 0 ． 8 ± 6 ． 2 1 ) d 。4 組大鼠的生存曲線如圖1 ， 分析顯示：T M — M S 治療大鼠的生存期較其他各組顯著延長(zhǎng)( P < 0 ． 0 5 ) 。

    2．2 T M—M S 對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響

   荷瘤大鼠組頭顱M R I 平掃+ 增強(qiáng)提示：顱內(nèi)基底節(jié)區(qū)類(lèi)圓形占位， 長(zhǎng)T 1 長(zhǎng)T 2 均明顯強(qiáng)化， 腦室受壓， 中線結(jié)構(gòu)有移位。假手術(shù)組和空載體組腫瘤體積分別為( 5 6．4 ± 6．9 2 )mm3。和( 5 8．2 ± 5．3 6 ) mm3。兩者之間無(wú)明顯差異( P >0 ．0 5 ) 。經(jīng)T M 治療后腫瘤體積有所縮小， 為( 4 6．7± 7．2 8 ) mm3，與假手術(shù)組之問(wèn)有明顯差異( P < 0 ． 0 5 ) 。經(jīng)T M—M S 治療后腫瘤體積顯著縮小，為( 3 1．2 ± 6．2 1 ) mm3，與假手術(shù)組之間有明顯差異( P < 0 ．0 5 ) ，與T M 治療組相比， 也有顯著差異( P < 0 ．0 5 ) 。4 組大鼠腫瘤體積之間有差異(方差分析：F = 3 4 ．3 8 5 1 ，JP = 0 ．0 0 3 2 ) 。

    2．3 大鼠腦膠質(zhì)瘤組織的病理變化

    光鏡下H—E 染色觀察各只大鼠均可見(jiàn)到膠質(zhì)瘤，細(xì)胞呈假柵欄狀或珊瑚狀排列， 密集成群，并向正常腦組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)。腦組織與腫瘤交界處可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)，邊界較模糊。經(jīng)T M 或T M—M S治療后瘤組織中�？梢�(jiàn)到壞死和囊變?cè)睢?

    2．4 T M—M S 對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織P C N A 表達(dá)的抑制采用P C N A 表達(dá)陽(yáng)性率作為腫瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)定的指標(biāo)，P C N A 陽(yáng)性細(xì)胞的胞核或( 和) 胞質(zhì)中出現(xiàn)了棕黃色顆粒。假手術(shù)組和空載體組腫瘤P C N A 表達(dá)陽(yáng)性率分別為( 6 3 ．2 ±5 ．9 ) ％ 和( 6 2 ．1 ± 7．8 )％ ，兩者之間無(wú)明顯差異( P> 0．0 5 ) 。經(jīng)T M 治療后，腫瘤P C N A 表達(dá)陽(yáng)性率有所減少，為( 4 1 ． 7 ± 6 ． 7 ) ％ ， 與假手術(shù)組之間有明顯差異( P < 0．0 1 ) 。經(jīng)T M — M S 治療后， 腫瘤P C N A 表達(dá)陽(yáng)性率顯著減少， 為( 2 0．2 ± 4．3 ) ％ ，與假手術(shù)組之間有明顯差異( P < 0 ． 0 1 ) ， 與T M 治療組相比也有顯著差異( P < 0 ． 0 5 ) 。

    2．5 T M—M S 誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

    T U N E L 法檢測(cè)結(jié)果顯示，假手術(shù)治療大鼠膠質(zhì)瘤組織中可見(jiàn)少量細(xì)胞核呈棕黃染色， 為凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為( 8 ． 6 3 ± 1 ． 5 2 ) ％ ；空載體治療大鼠膠質(zhì)瘤的細(xì)胞凋亡率為( 9 ． 2 5 ± 2 ． 3 1 ) ％ ；T M 治療大鼠膠質(zhì)瘤出現(xiàn)稍多的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為( 1 6．14 ± 3．4 2 ) ％ ；T M—M S 治療大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率為( 3 2．3 1 ± 3．1 7 ) ％ ，凋亡率最高。三者問(wèn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 方差分析：F = 9 4 ．0 5 4 3 ，P = 0．0 0 1 2 ) 。結(jié)果說(shuō)明T M—M S 能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

    3  討論

    惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療仍主張采用包括手術(shù)、放療、化療和免疫治療等在內(nèi)的綜合治療。藥物治療和治療手段的改進(jìn)是目前研究的重要方向之一。傳統(tǒng)的全身藥物有以下的局限性：( 1 ) 多數(shù)的化療藥物為水溶性，相對(duì)分子質(zhì)量較大， 難以透過(guò)血腦屏障；( 2 ) 以卡氮芥( B C N U ) 為代表的亞硝基脲類(lèi)藥物為脂溶性制劑， 雖能透過(guò)血腦屏障但全身用藥引起相當(dāng)大的毒性作用；( 3 ) 半衰期短，在腦內(nèi)難以維持穩(wěn)定的有效濃度。

    近十年來(lái)，藥物“ 緩釋劑型”“瘤內(nèi)給藥” 的方法為膠質(zhì)瘤的治療開(kāi)辟了新途徑。腫瘤內(nèi)或間質(zhì)內(nèi)用藥的優(yōu)越性在于：( 1 ) 局部給藥，避開(kāi)了血腦屏障，提高了局部藥物濃度，且藥物的選擇不再受其理化性質(zhì)的影響；( 2 ) 藥物直接與腫瘤細(xì)胞接觸， 全身毒性作用��；( 3 ) 使“ 峰谷現(xiàn)象” 降低到最低程度；治療時(shí)間短， 費(fèi)用少。臨床觀察發(fā)現(xiàn)， 9 0 ％ 的惡性膠質(zhì)瘤通常在腫瘤切除部位外圍的2 c m 內(nèi)復(fù)發(fā)， 極少發(fā)生中樞神經(jīng)以外的轉(zhuǎn)移。這一特點(diǎn)為腫瘤內(nèi)或間質(zhì)內(nèi)用藥提供了治療空間。

    聚乳酸一羥基乙酸共聚物[P L G A]是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種由典型的d 一羥基酸聚合而成的一種無(wú)毒、無(wú)刺激性的完全生物降解性材料。由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美國(guó)F D A 批準(zhǔn)為藥用高分子材料使用。研究證實(shí)， P L G A 在腦組織中也具有很好的生物相容性和生物降解性爭(zhēng)如。本研究將P L G A 為載體，研究制備了可供腦部植人用的替莫唑胺緩釋微球制劑( T M ． M S ) 治療腦膠質(zhì)瘤�？蛰d體組生存期與空白組之間無(wú)明顯延長(zhǎng)， 說(shuō)明P L G A 對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)并無(wú)抑制作用。本研究結(jié)果顯示：替莫唑胺口服治療荷瘤大鼠， 其大鼠的生存期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與P r a d o s等在一項(xiàng)多中心II 期臨床試驗(yàn)中證實(shí)的T M 能夠明顯延長(zhǎng)患者無(wú)進(jìn)展生存期、提高生存率、改善生活質(zhì)量的報(bào)道吻合。腫瘤局部置入替莫唑胺緩釋微球的荷瘤組大鼠， 其生存期明顯長(zhǎng)于替莫唑胺口服組， 其原因主要是由于替莫唑胺微球在腫瘤局部緩慢釋放藥物，使腫瘤局部獲得了較高的替莫唑胺藥物濃度；同時(shí)替莫唑胺微球緩慢釋放延長(zhǎng)了藥物作用時(shí)間， 使腫瘤細(xì)胞能更長(zhǎng)期地受到藥物作用。本研究頭顱M R I 影像學(xué)結(jié)果也顯示，替莫唑胺微球組的腫瘤體積較替莫唑胺口服組明顯縮小，該結(jié)果說(shuō)明替莫唑胺緩釋微球較替莫唑胺口服制劑更能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

    PCNA是一種相對(duì)分子質(zhì)量為36 000的多肽，僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)，被用于研究惡性腫瘤的細(xì)胞增殖和判斷其惡性程度，對(duì)腫瘤的治療及預(yù)后的判斷有重要意義。本研究檢測(cè)結(jié)果提示，各組間PCNA陽(yáng)性率有顯著差異，替莫唑胺口服組較對(duì)照組為低，說(shuō)明替莫唑胺通過(guò)口服能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，替莫唑胺緩釋微球組較替莫唑胺口服組更低，說(shuō)明替莫唑胺微球在腫瘤局部的緩慢釋放較該藥物口服吸收更能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

    替莫唑胺是一種咪唑四嗪類(lèi)具有抗腫瘤活性的烷化劑，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是其主要的作用機(jī)制。本研究通過(guò)TUNEL法研究各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況，研究結(jié)果顯示，替莫唑胺口服組腫瘤細(xì)胞凋亡率要明顯高于對(duì)照組，而替莫唑胺緩釋微球組腫瘤細(xì)胞凋亡率則更高。該結(jié)果與替莫唑胺微球較替莫唑胺口服更能抑制腫瘤生長(zhǎng)的結(jié)果相吻合，考慮主要與替莫唑胺微球能使瘤床局部獲得高藥物濃度和替莫唑胺微球緩慢釋放藥物使藥物能更長(zhǎng)時(shí)間作用于腫瘤細(xì)胞有關(guān)。研究結(jié)果初步表明，替莫唑胺緩釋微球間質(zhì)植入治療較替莫唑胺口服能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、縮小腫瘤體積、延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存時(shí)間。替莫唑胺緩釋微球有望成為局部治療膠質(zhì)瘤的優(yōu)選藥物。

    [參考文獻(xiàn)]
   

    （略）

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