鬼臼類植物產(chǎn)鬼臼毒素(疣迪搽劑)內(nèi)生真菌的篩選

鬼臼類植物是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亞科(Podophylloideae)桃兒七屬(Sinopodophyllum)、山荷葉屬(Diphylleia)、八角蓮屬(Dysosma)及足葉草屬(Podophyllum)植物的統(tǒng)稱。鬼臼類植物是一類含有顯著生物活性物質(zhì)，又有悠久應(yīng)用歷史的藥用植物，用于治療多種疾癥。1880年，Podwyssotzkii從美洲桃兒七(Podophyllum peltatum)的樹脂中分出了結(jié)晶性成分鬼臼毒素(podophyllotoxin)，后來(lái)證明鬼臼毒素具有顯著的抗癌活性；其衍生物鬼臼乙叉苷(VP₁₆)、鬼臼噻吩苷(VM₂₆)等已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市，用于治療多種癌癥。目前鬼臼毒素主要從鬼臼類植物根、莖中提取，過(guò)度采挖致使植物資源遭到嚴(yán)重破壞；44學(xué)合成鬼臼毒素的難度大，成本高，全合成不經(jīng)濟(jì)；植物組培雖取得了一定進(jìn)展，但還無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1993年，Strobel等從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中分到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌安德氏紫杉霉(Tax-omyces andreanae)，因而開始了利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)抗癌活性成分新途徑的研究。為此，我們開展了對(duì)桃兒七、南方山荷葉、川八角蓮等植物內(nèi)生真菌的研究，現(xiàn)報(bào)道其中部分工作結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 材料

桃兒七(Sinopoclophyllum hexandrum)、南方山荷葉(Diphylleia sinensis)采自云南省中甸縣，川八角蓮(Dysosma z~itchii)采自云南省蒿明縣。鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(m A)、查氏培養(yǎng)基、促孢培養(yǎng)基、改良基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(MM)。

1.3 內(nèi)生真菌的分離和純化

植物樣品采集后立即處理。取三種植物地下莖，按下列程序表面消毒：自來(lái)水沖洗干凈—町5％酒精漂洗(3～5min)一無(wú)菌水沖洗3～4次。1％升汞漂洗(10～30s)一無(wú)菌水沖洗5次。將上述處理過(guò)的莖在無(wú)菌條件下切割成約0.5crn×0.5 era的小片(取韌皮部)，然后將小片種植于PDA平皿上，置于28℃溫箱培養(yǎng)3～7 d后，即可見(jiàn)樣品切割過(guò)的邊緣長(zhǎng)出菌絲，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)移到PDA斜面上備用。

為檢查表面消毒是否徹底，做了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將上述同樣條件處理過(guò)的莖段不作切割直接種植于PDA平皿上，置于相同條件下培養(yǎng)，結(jié)果對(duì)照用的莖段周圍無(wú)任何菌長(zhǎng)出，多次重復(fù)如此，證明所分到的菌是韌皮部?jī)?nèi)的，而不是表面的附生菌。

1.4 產(chǎn)鬼臼毒素菌株的篩選

1.4.1 內(nèi)生真茵的液體培養(yǎng)將100 ml改良MM液體培養(yǎng)基裝于250 ml三角瓶中，每個(gè)菌號(hào)裝5瓶，共500 ml的量，滅菌，挑適量菌絲或孢子接種于三角瓶中，于28℃搖床(110 r／min)培養(yǎng)7～10 d。進(jìn)行提取。

1.4.2 提取方法發(fā)酵液500 rnl一過(guò)濾一濾液(菌絲冷凍數(shù)十分鐘，搗碎，加入濾液) Ⅱ等體積氯仿，萃取過(guò)夜一取氯仿層蒸餾濃縮一置干凈青霉素小瓶中備用。

1.4.3 TLC分析硅膠G板購(gòu)自青島海洋化工廠。兩種展開劑為氯仿：甲醇(95：5 v／v)；氯仿：乙酸乙酯(8：2 v／v)。濃硫酸一乙醇(1：1 v／v))顯色(120℃，5 min)。

1.4.4 HPLC檢測(cè)Waters 201型HPLC儀；檢測(cè)器 81。HPLC條件：柱系Bondapak C-18 10 300×3.9 mm(i.d)；流動(dòng)相CHaCN：H20=50：50(v／v)；流速1.0 ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)UV254 rim；進(jìn)樣量10。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離

從上述三種植物中共分得內(nèi)生真菌92株，其中從桃兒七分得內(nèi)生真菌28株，占總分離菌株數(shù)的3096；南方山荷葉內(nèi)生真菌35株，占總分離菌株數(shù)的38％；川八角蓮內(nèi)生真菌29株，占總分離菌株數(shù)的3296。僅從三種植物地下莖韌皮部就分離出92株內(nèi)生真菌，充分顯示出植物內(nèi)生真菌資源的豐富。叢梗孢屬、青霉屬為三種植物內(nèi)生真菌共有的優(yōu)勢(shì)屬，而無(wú)孢菌群、曲霉屬、毛殼菌屬、擬青霉屬為三種植物內(nèi)生真菌常見(jiàn)屬，其余為偶見(jiàn)。這說(shuō)明三種植物內(nèi)生真菌有一定共性，但植物種類不同，生境不同，內(nèi)生真菌也存在著較大差異。

2.2 產(chǎn)鬼日毒素菌株的篩選

經(jīng)TLC初步分析表明，在92株內(nèi)生真菌中，共有8株菌的液體發(fā)酵提取物出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品遷移率(Rf)相同的斑點(diǎn)，它們可能產(chǎn)鬼臼毒素。為了證實(shí)它們是否確能產(chǎn)鬼臼毒素，采用HPLC對(duì)它們的發(fā)酵提取物進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果表明，其中2株不產(chǎn)鬼臼毒素，其余6株能產(chǎn)鬼臼毒素，占總分離菌株數(shù)的6.596，其中桃兒七產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌2株，占分離自該植物內(nèi)生真菌總數(shù)的7％；南方山荷葉產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌1株，占分離自該植物內(nèi)生真菌總數(shù)的3％ ；川八角蓮產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌3株，占分離自該植物內(nèi)生真菌總數(shù)的10％。這也表明植物內(nèi)生真菌中存在著豐富的產(chǎn)抗癌活性成分的真菌資源。

2.3 產(chǎn)鬼臼毒素菌株屬的分布

從三種植物分離的產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌分布在青霉屬(Penicillium)等4個(gè)屬中。其中青霉屬為三種植物產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌的共有屬，但種不同。從桃兒七分離的是點(diǎn)青霉(P.notaztum)，從南方山荷葉分離的是糾錯(cuò)青霉(P.implicatum)，從川八.角蓮分離的是產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum o這說(shuō)明，產(chǎn)鬼臼毒素內(nèi)生真菌資源具有豐富的多樣性。

3 討論

植物內(nèi)生真菌，是指生活在植物體內(nèi)或在其生活史的一定階段處于植物體內(nèi)的一類真菌，被感染的宿主植物(至少是暫時(shí))不表現(xiàn)出外在病癥，可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)證明其內(nèi)生。這類菌涵蓋面相當(dāng)廣，包括菌根真菌和植物病原真菌在內(nèi)。也有一些研究者認(rèn)為內(nèi)生真菌是指存在于健康植物莖葉中，形成不明顯侵染的一類真菌。植物內(nèi)生真菌在植物微生態(tài)系統(tǒng)中，長(zhǎng)期與宿主建立了和諧的協(xié)同關(guān)系，其次生代謝產(chǎn)物十分豐富，具有多種生物活性n 3l。有的內(nèi)生真菌與宿主植物只形成不太明顯的共生或伴生關(guān)系，有的對(duì)宿主體內(nèi)某些活性成分的形成產(chǎn)生重要影響，而有的則能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分。

通過(guò)研究，我們發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌資源十分豐富。植物種屬不同，生境不同，內(nèi)生真菌存在較大差異。某些植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的抗癌活性成分是抗癌藥物研究和開發(fā)的重要資源。同時(shí)，植物內(nèi)生真菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的深遠(yuǎn)意義，又有多方面的應(yīng)用潛力，是人類亟待保護(hù)和開發(fā)利用的寶貴資源。在植物內(nèi)生真菌研究中，還應(yīng)重視以下問(wèn)題：

(1)采樣季節(jié)不同，同一地點(diǎn)同一植株的同一部位分到的內(nèi)生真菌也存在一定差別，這可能是由于植物內(nèi)生菌有的能長(zhǎng)久存在于植物組織內(nèi)，有的則只在整個(gè)生活史中存在一段時(shí)間所致。

(2)采用的研究方法和手段不同，也會(huì)造成對(duì)植物內(nèi)生真菌分離準(zhǔn)確性的影響。目前對(duì)植物內(nèi)生真菌種類數(shù)量的估計(jì)依賴于培養(yǎng)基，用哪些培養(yǎng)基才能反映內(nèi)生真菌在宿主組織中的真實(shí)種群及數(shù)量，尚需探討。另外，在自然條件下，微生物本來(lái)是混居的，并非單獨(dú)存在。不少微生物至今難以人工培養(yǎng)、檢測(cè)，許多微生物只有混合培養(yǎng)時(shí)才能生長(zhǎng)，而在純培養(yǎng)時(shí)就不能生長(zhǎng)。因此，內(nèi)生真菌的分析研究有待深人，在方法手段上也有待改進(jìn)。

(3)植物內(nèi)生真菌的遺傳穩(wěn)定性是值得深人探討的問(wèn)題。所分離到的菌株，在1~3代時(shí)可保持產(chǎn)宿主某些活性成分(抗癌物質(zhì)等)的特性，而多次轉(zhuǎn)接后往往減弱，甚至消失這種特性，其中原因待查，尤其涉及到與宿主的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系和生態(tài)條件等。

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