神經(jīng)病理和神經(jīng)化學(xué)研究表明，老年性癡呆(Alzheimer病)患者由于腦內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)缺乏，其腦內(nèi)乙酰膽堿的濃度和合成明顯降低，大腦皮質(zhì)中出現(xiàn)老年斑，神經(jīng)原纖維紊亂。由于NGF不能通過(guò)血腦屏障，本實(shí)驗(yàn)將能分泌NGF的細(xì)胞微包囊植入腦室內(nèi)，通過(guò)檢查移植后腦內(nèi)基底前腦神經(jīng)元的數(shù)量，來(lái)了解和確定NGF對(duì)基底前腦神經(jīng)元的保護(hù)作用。

　　材料與方法

　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　本組選用6只老年雌性恒河猴，年齡在24～29歲之間。

　　二、手術(shù)方法
　　用氯胺酮將動(dòng)物麻醉后再行異氟烷全身麻醉，氣管插管，將頭置于定向儀架上固定。取頭頂部正中直切口，長(zhǎng)約6 cm，牽開頭皮，在右矢狀竇旁用電鉆磨一骨瓣，形成一1.5 cm×4 cm大小的骨窗。瓣形切開硬腦膜，翻向中線側(cè)。在手術(shù)顯微鏡下牽開大腦縱裂，縱行切開胼胝體，從頂部打開側(cè)腦室，在Moron氏孔水平可見一白色束狀纖維即為穹隆，用一鈍性小鉤將其從底部鉤起，切斷。切斷穹隆并確定無(wú)出血后，立即將5根裝有能分泌人NGF的小牛腎纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞的多聚微包囊并排植入同側(cè)側(cè)腦室內(nèi)。3只猴接受可分泌人NGF的細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，另3只猴接受的移植細(xì)胞不能分泌NGF，作為對(duì)照組。然后復(fù)置骨瓣，逐層縫合。動(dòng)物自然蘇醒。

　　三、組織學(xué)檢查

　　術(shù)后3～4周再次將動(dòng)物麻醉，經(jīng)原入路開顱，去骨瓣后在顯微鏡下取出微包囊，進(jìn)行組織學(xué)和神經(jīng)化學(xué)檢查。開胸，從左心室灌注生理鹽水，至右心房流出液清亮后，繼續(xù)灌注濃度為400 g/L苦味酸固定液。開顱，完整取出腦，置于300 g/L的高糖溶液中，冰箱內(nèi)冷凍保存。腦組織塊脫水后，冰凍切片40 μm厚，分別進(jìn)行尼氏染色和乙酰膽堿酯酶(AchE)、膽堿乙酰化酶(ChAT)、多巴胺β-羥化酶(DβH)、β-淀粉樣酶和低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(p75NGFr)的免疫組織化學(xué)染色 。

    結(jié)　　果

　　所有猴腦顳葉、頂葉、杏仁核和海馬內(nèi)的切片均可見有大量的β-淀粉樣酶免疫陽(yáng)性的斑塊樣結(jié)構(gòu)，兩組動(dòng)物的斑塊數(shù)量無(wú)差別。術(shù)后動(dòng)物腦切片尼氏染色顯示，位于側(cè)腦室孔水平可見左側(cè)穹隆完全被切斷，導(dǎo)致同側(cè)海馬內(nèi)的AchE陽(yáng)性纖維較對(duì)側(cè)明顯減少。隔區(qū)免疫組織化學(xué)檢查顯示，對(duì)照組隔區(qū)p75NGFr陽(yáng)性神經(jīng)元較對(duì)側(cè)減少53%，殘余細(xì)胞呈萎縮狀，而實(shí)驗(yàn)組只較對(duì)側(cè)減少7%～23%； 實(shí)驗(yàn)組的ChAT免疫陽(yáng)性神經(jīng)元在隔區(qū)內(nèi)計(jì)數(shù)比對(duì)側(cè)減少0～37%，而對(duì)照組則較對(duì)側(cè)減少57%～75%。實(shí)驗(yàn)組的膽堿能陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)正常，而對(duì)照組的神經(jīng)元顯示萎縮。實(shí)驗(yàn)組在隔區(qū)內(nèi)可見有膽堿能神經(jīng)纖維及p75NGFr陽(yáng)性神經(jīng)纖維的發(fā)芽反應(yīng)，而對(duì)照組則無(wú)此反應(yīng)。有1只猴的1根微包囊被插入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，其NGF受體能陽(yáng)性神經(jīng)纖維在移植物周圍形成網(wǎng)狀。雖然這些神經(jīng)纖維叢來(lái)自何處尚不清楚，但可以確定的是，這些纖維不是來(lái)自交感神經(jīng)系統(tǒng)，因?yàn)檫@些纖維較細(xì)、迂曲，DβH免疫組織化學(xué)染色陰性。另外，在這些神經(jīng)纖維叢內(nèi)，也可見很少量的神經(jīng)元，但由于其量太少，不可能形成網(wǎng)狀。每只動(dòng)物腦內(nèi)移植的細(xì)胞囊在移植前每24小時(shí)可分泌(44.65±0.95)ng的人NGF，從動(dòng)物腦內(nèi)取出后每24小時(shí)可分泌NGF 9.6 ng。

　　討　　論

　　本實(shí)驗(yàn)表明，將能分泌人NGF的細(xì)胞囊移植到切斷穹隆的老年猴腦室內(nèi)后，NGF對(duì)變性的老年靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腦基底前腦神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)和趨化效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)用猴的年齡相當(dāng)于人75～87歲，對(duì)照組可見基底前腦的膽堿能神經(jīng)變性明顯，移植能分泌NGF的細(xì)胞后，有效地預(yù)防了膽堿能神經(jīng)元的損傷和變性，還能誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)纖維的發(fā)芽反應(yīng)，在最老猴的腦內(nèi)也可觀察到這種變化。結(jié)合過(guò)去我們?cè)谀昵嗪锼�做的�?shí)驗(yàn)結(jié)果，可見這種效應(yīng)在任何年齡的靈長(zhǎng)類動(dòng)物都是存在的。損傷和移植后，膽堿能神經(jīng)元比神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體能神經(jīng)元對(duì)這種效應(yīng)更敏感。

　　由于NGF不能容易地通過(guò)血腦屏障，微包囊移植可能成為一種有效的途徑。因?yàn)檫@種微包囊可使具有營(yíng)養(yǎng)作用的小分子雙向通過(guò)，而免疫分子卻不能通過(guò)，所以異體移植時(shí)不用免疫抑制劑也可長(zhǎng)期存活。在移植物周圍，只有很輕微的星形細(xì)胞增生，而微包囊內(nèi)的細(xì)胞卻存活很好，且分泌功能存在。

　　NGF已被用于治療由于膽堿能神經(jīng)元缺乏所引起的老年性癡呆病，Olson等對(duì)1例患者靜脈注射NGF，發(fā)現(xiàn)其記憶能力有所改善，而其它認(rèn)識(shí)能力無(wú)改善。我們認(rèn)為，在NGF廣泛應(yīng)用于臨床之前，應(yīng)當(dāng)認(rèn)真評(píng)價(jià)其在靈長(zhǎng)類的效應(yīng)、最佳劑量和給藥途徑。我們?cè)�在年青猴的研究中發(fā)現(xiàn)，移植前后微包囊內(nèi)的細(xì)胞分泌能力相當(dāng)，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，移植數(shù)周后，微包囊內(nèi)的細(xì)胞分泌能力下降，而此時(shí)仍對(duì)基底前腦神經(jīng)元有影響，說(shuō)明低水平的NGF即可成功地預(yù)防基底前腦神經(jīng)元的變性，如果這種保護(hù)作用能持續(xù)存在，就可用這種方法來(lái)治療老年性癡呆。

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