泰素帝誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

來(lái)源：新特藥房藥訊作者：百濟(jì)動(dòng)態(tài) 瀏覽：發(fā)布時(shí)間：2008/2/28 9:00:00

李瑛　石廷章　趙衛(wèi)紅

　　摘　要：目的　探討泰素帝誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法　應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、DNA凝膠電泳、Annexin v標(biāo)記等方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因 fas、bcl-2、c-myc表達(dá)的變化。結(jié)果　泰素帝對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系 a549細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，使細(xì)胞分裂阻滯于G2M期，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)聚集或斷裂，DNA凝膠電泳顯示清晰的DNA梯形條帶，F(xiàn)AGS檢測(cè)在G1期之前出現(xiàn) sub-G1峰，凋亡率最高為 15.69%，Annexin V標(biāo)記的方法檢測(cè)凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，壞死和凋亡共存。在泰素帝誘導(dǎo) a549凋亡的過(guò)程中，凋亡相關(guān)基因 Fas轉(zhuǎn)錄水平比用藥前增強(qiáng)，bcl-2和c-myc無(wú)明顯變化。結(jié)論　除了壞死，凋亡也為泰素帝抑瘤的機(jī)制之一。泰素帝誘導(dǎo) a549凋亡可能主要與促進(jìn) Fas基因表達(dá)有關(guān)。

　　主題詞：肺腫瘤；腺癌；泰素帝；細(xì)胞凋亡；Fas基因

　　泰素帝是 1986年由法國(guó)羅納普朗克*樂(lè)安公司首先生產(chǎn)的一種半合成抗癌新藥。其結(jié)構(gòu)類似紫杉醇，是從歐洲紫杉針葉提取加工的，有促進(jìn)細(xì)胞微管聚合、抑制微管解聚的作用，使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的有絲分裂。泰素帝的來(lái)源較紫杉醇更易獲得，對(duì)某些腫瘤的殺傷作用是紫杉醇的2倍，并且對(duì)某些過(guò)度表達(dá)P-糖蛋白的耐藥細(xì)胞株仍然有效［1］。經(jīng)多年的臨床研究結(jié)果表明，其對(duì)多種癌癥有效，特別是對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌和晚期非小細(xì)胞癌［2］。在白血病和乳腺癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)泰素帝的細(xì)胞毒性與其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的作用有關(guān)［3，4］。泰素帝作為治療非小細(xì)胞肺癌最有前景的新藥［5］，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示，對(duì)非小細(xì)胞肺癌有生長(zhǎng)抑制和殺傷作用，但尚未見(jiàn)泰素帝誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的報(bào)道。我們選擇人肺腺癌株 a549來(lái)探討泰素帝誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的比例及機(jī)制，為泰素帝臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

　　一、材料

　　人肺腺癌細(xì)胞系 A549購(gòu)自解放軍總醫(yī)院腫瘤生物研究所。泰素帝為法國(guó)羅納普朗克*樂(lè)安公司提供。bcl2引物擴(kuò)增產(chǎn)物為170 bp，c-myc 為170 bp, Fas 為190 bp，β-actin (內(nèi)標(biāo))為 450 bp。

　　二、方法

　　1.細(xì)胞培養(yǎng)： A549用含 10%小牛血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37℃、5% cO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

　　2.形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞懸液離心涂片，瑞氏染液染色 5 min，光鏡下觀察。

　　3.電鏡觀察：收集 106細(xì)胞，離心后以 3%戊二醛固定24 h，1% OsO4固定2 h，常規(guī)脫水、包埋、聚合、切片、染色。

　　4.DNA 凝膠電泳：采用盧圣棟［6］的快速法提取 dNA。細(xì)胞懸液溶于 DNA提取液1中，加入 NP-40，混勻后離心棄上清；沉淀加入 dNA提取液 2及6 mol/L NaCl，混勻后離心取上清，用乙酸銨、冰乙醇沉淀 dNA；沉淀物溶于 TE緩沖液；經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳。

　　5.流式細(xì)胞儀分析：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)(FACS)常規(guī)預(yù)處理細(xì)胞后上機(jī)測(cè)定細(xì)胞周期分布及凋亡率，以未加藥者為對(duì)照組。

　　6.Annexin V標(biāo)記：使用 Boehringer Mannheim 公司試劑盒 annexin-V-flous。收集 106/ml 細(xì)胞，加入 200 μl工作液，室溫下10～15 min后上機(jī)檢測(cè)。

　　7.RT-PCR：首先提取 RNA，收集 107細(xì)胞加入 200 μl裂解液及氯仿，離心取上層水相；加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(24∶24∶1)，離心吸取上清；加入醋酸鈉和異丙醇，-20℃放置20 min，離心棄上清，室溫晾干。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，樣品加入15 μl RT液，1 μl 酶混合離心數(shù)秒，42℃水浴 30 min。最后進(jìn)行 pCR反應(yīng)，加入 PCR液 20 μl，1 μl Taq酶，1滴石蠟油，離心數(shù)秒，上機(jī)進(jìn)行 pCR循環(huán)；變性 94℃ 45 s，55℃退火45 s，72℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán)。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察照相。

　　8.統(tǒng)計(jì)分析：均采用 6.04版 SAS軟件，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：0.1μmol/L泰素帝作用于A549 72 h時(shí)，光鏡下觀察有10%～20%細(xì)胞出現(xiàn)固縮，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，斷裂成數(shù)個(gè)圓形顆粒，胞膜仍完整。電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞體積變小，胞漿凝縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松與胞膜融合成一個(gè)個(gè)空泡，核內(nèi)染色質(zhì)凝聚成新月?tīng)罡街诤四み?圖1)。以上形態(tài)改變表明，A549在泰素帝誘導(dǎo)下出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。另有部分腫脹細(xì)胞，胞膜已破碎，細(xì)胞器崩潰，染色質(zhì)疏松為壞死細(xì)胞。

　　當(dāng)泰素帝劑量加大時(shí)，則花團(tuán)樣多核細(xì)胞更多，腫脹破裂的壞死細(xì)胞比例更大，而核固縮的凋亡細(xì)胞并未增多。

　　2.DNA 凝膠電泳分析：0.1 μmol/L泰素帝作用于 A549 72 h始出現(xiàn)梯形條帶，在(0.01～10)μmol/L 范圍內(nèi)作用 72 h均出現(xiàn)凋亡特有的梯形條帶，但當(dāng)劑量加大至10μmol/L時(shí)，其背景夾雜有壞死的膜狀改變(圖2)。

　　3.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)：經(jīng) FCM進(jìn)行周期檢測(cè)，泰素帝 0.1 μmol/L作用12 h已有明顯的G2M阻滯；當(dāng) 1 μmol/L作用 48 h時(shí)，G2M期細(xì)胞高達(dá)80.01%。第3天以后，由于部分阻滯的細(xì)胞發(fā)生死亡，使G2M、G1、S期細(xì)胞均相應(yīng)減少，Sub-G1期細(xì)胞增多。亞二倍體峰 sub-G1峰的面積代表凋亡細(xì)胞的比例(apo%)。泰素帝 0.1 μmol/L作用 A549 72 h的 apo%最高為15.69%，其他濃度時(shí)間的 apo%均低于此值。

C：A549對(duì)照組；1～4：0.01，0.1，1.0，10μmol/L泰素帝作用72 h組；Mr：PBR 322BstN1圖2　DNA凝膠電泳結(jié)果

　　4.Annexin-V-flous標(biāo)記：磷脂酰絲氨酸(phosphatidylscrine, pS)正常時(shí)分布于細(xì)胞膜內(nèi)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期便從膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)至膜外。Annexin v在Ca2+存在時(shí)可以和PS特異結(jié)合，故 Annexin V試劑盒可作為檢測(cè)凋亡的早期手段，且較敏感［7］。結(jié)合碘化丙啶(PI)染色，可將細(xì)胞分為4種屬性：Ⅰ象限：PI高染，異硫氰酸熒光素(FITC)低染，為壞死細(xì)胞；Ⅱ象限：PI、FITC均高染為凋亡后壞死細(xì)胞及部分壞死細(xì)胞；Ⅲ象限：PI、FITC均低染為正常細(xì)胞；Ⅳ象限：PI低染，F(xiàn)ITC高染，為凋亡細(xì)胞。因Ⅱ象限由凋亡后壞死細(xì)胞和部分壞死細(xì)胞兩部分組成，無(wú)法區(qū)分，故除了對(duì)Ⅰ和Ⅳ象限分別進(jìn)行凋亡和壞死的粗略統(tǒng)計(jì)外，還應(yīng)考慮Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ象限的數(shù)值(表1)。

　　泰素帝0.1 μmol/L作用于A549 24h，壞死比對(duì)照組增加了3.3倍，而凋亡比例不高。第2天壞死比例下降，凋亡比例增加，是第1天的2.4倍，象限Ⅱ(凋亡后壞死和部分壞死)為對(duì)照組的 3.8倍。結(jié)合象限Ⅱ+Ⅳ和Ⅰ+Ⅱ的數(shù)值變化，提示凋亡后壞死占有相當(dāng)比重。

　　5.凋亡的相關(guān)基因：泰素帝 0.1 μmol/L作用于A549 24 h后，F(xiàn)as基因轉(zhuǎn)錄較用藥前增強(qiáng)，而c-myc和bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯變化(圖3)。

表1　泰素帝1.0 μmol/L對(duì)A549的annexin V檢測(cè)

組別	時(shí)間　　(d)	細(xì)胞百分比(%)
組別	時(shí)間　　(d)	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅱ+Ⅳ	Ⅰ+Ⅱ
對(duì)照組	1	2.8	8.2	80.6	8.5	16.7	11.0
泰素帝	1	12.1	17.8	66.8	3.4	21.2	29.9
泰素帝	2	11.6	31.4	48.8	8.2	39.6	43.0

討論

　　1.凋亡的檢測(cè)：本實(shí)驗(yàn)采用多方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)0.1μmol/L泰素帝對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549有誘導(dǎo)凋亡的作用，其作用72 h的apo%最高，此濃度為周期阻滯峰值濃度(1 μmol/L)的1/10。另外，凋亡的發(fā)生遲于周期阻滯，開(kāi)始于48 h(即周期阻滯達(dá)峰值時(shí))，72 h達(dá)峰值后又逐漸下降。即在腫瘤細(xì)胞陸續(xù)進(jìn)入 g2M期阻滯后，凋亡的比例也開(kāi)始增加，提示凋亡的發(fā)生可能與周期阻滯有關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也有類似發(fā)現(xiàn)，Ronald等［8］在移植了 mca-4腺瘤的小鼠中觀察泰素帝的作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，瘤細(xì)胞在周期阻滯之后發(fā)生了凋亡和壞死，但是在鱗癌 sCC-VII，盡管周期阻滯非常明顯卻沒(méi)看到凋亡。有關(guān)二者的確切關(guān)系尚須深入研究。

　　2.泰素帝誘導(dǎo)凋亡在其抗腫瘤機(jī)制所處的地位：泰素帝對(duì)周期的阻滯作用已得到公認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)除觀察到明顯的周期阻滯現(xiàn)象外，還發(fā)現(xiàn)在 g2M期阻滯后，大部分細(xì)胞死亡，死亡方式除了壞死外，還有凋亡，究竟凋亡在泰素帝對(duì)A549細(xì)胞系的作用中處于什么地位呢?FCM檢測(cè)其凋亡率最高為15.69%，在實(shí)體瘤誘導(dǎo)的凋亡中屬中低水平。另外Annexin-V實(shí)驗(yàn)看到，壞死從始至終存在，且比例較高；而凋亡則早期比例較低，晚期凋亡細(xì)胞和凋亡后壞死細(xì)胞才逐漸增多。壞死似乎更占有優(yōu)勢(shì)。

　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也有類似發(fā)現(xiàn)。Ronald等［8］曾報(bào)道在移植了各種腫瘤的小鼠實(shí)驗(yàn)中，泰素帝可引起明顯的周期阻滯以及相當(dāng)?shù)偷牡蛲龇磻?yīng)(相對(duì)紫杉醇來(lái)說(shuō))，但是泰素帝的療效與二者均不相關(guān)，細(xì)胞的溶解壞死被認(rèn)為是泰素帝殺傷腫瘤的主要方式。

　　3.凋亡相關(guān)基因：Fas為TNF受體超家族成員，主要表達(dá)于活化的 t細(xì)胞表面，并可表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，包括造血系統(tǒng)腫瘤和非造血系統(tǒng)腫瘤。其在腫瘤的凋亡反應(yīng)中起重要作用，在泰素帝誘導(dǎo)A549凋亡的過(guò)程中其轉(zhuǎn)錄增加。

　　原癌基因bcl-2是迄今為止功能最明確的細(xì)胞凋亡拮抗基因。近年研究發(fā)現(xiàn)，泰素帝及紫杉醇等作用于微管系統(tǒng)的藥物，由于破壞了微管的完整性，導(dǎo)致 bcl-2磷酸化，從而促使細(xì)胞凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)中 A549細(xì)胞在使用泰素帝后 bcl-2表達(dá)并無(wú)明顯減少，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)bcl-2家族其他成員和bcl-2的蛋白產(chǎn)物含量有無(wú)變化，以判斷泰素帝致凋亡是否與bcl-2家族有關(guān)。

M：Mark；1：A549對(duì)照組；2：泰素帝處理組，每列上側(cè)條帶均為β-actin內(nèi)標(biāo)圖3　0.1 μmol/L泰素帝對(duì)A549作用24 h的Fas、bcl-2、c-myc基因檢測(cè)

　　c-myc是癌基因中核心蛋白 myc的家族成員，是細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期演進(jìn)的正調(diào)控基因。近年研究發(fā)現(xiàn)，它也參與凋亡過(guò)程，具有雙重性。泰素帝誘導(dǎo)A549的凋亡進(jìn)程中，c-myc轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)明顯變化。

　　通過(guò)泰素帝在人肺腺癌A549細(xì)胞系的抗腫瘤機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，可以看出泰素帝使腫瘤細(xì)胞分裂阻滯于G2M期，周期阻滯之后，腫瘤細(xì)胞以壞死和凋亡兩種方式死亡。其中Fas基因參與了泰素帝誘導(dǎo)A549凋亡的過(guò)程，這些都為該藥在非小細(xì)胞肺癌的治療應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。關(guān)于凋亡在泰素帝抑瘤機(jī)制中的地位，仍需繼續(xù)廣泛和深入的觀察研究。

圖1 經(jīng)電鏡觀察的A549細(xì)胞用藥前后的形態(tài)改變。1a:A549未經(jīng)泰素帝處理；1b：泰素帝0.1μmol/L作用24h，細(xì)胞核染色質(zhì)連聚，為凋亡早期改變。

　　作者單位：李瑛（100853　北京，解放軍總醫(yī)院腫瘤科)

　　石廷章（100853　北京，解放軍總醫(yī)院腫瘤科)

　　趙衛(wèi)紅（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所）

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