擇思達鹽酸托莫西汀膠囊在健康人體的藥動學研究

    托莫西汀(atomoxetine，商品名：擇思達)是第1個用于治療注意缺陷多動障礙(attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)的非興奮性藥物，目前已經在美國、英國、中國等多個國家上市并應用[1]。托莫西汀是一種去甲腎上腺素再攝取抑制劑，能選擇性抑制突觸前胺泵對去甲腎上腺素的再攝取，增強去甲腎上腺素的翻轉效應，從而改善多動癥的癥狀，間接促進認知的完成和注意力的集中[2,3]。有關托莫西汀的藥動學研究，國內未見中國人體內托莫西汀藥動學研究的文獻報道。本試驗對口服鹽酸托莫西汀膠囊后在人體內的藥動學過程進行研究。
　　
    1 儀器與材料
    1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)，包括G1379B自動脫氣機，G1310A自動調配四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A可調柱溫箱;Agilent 6410 triple quad LC/MS(美國Agilent);XW��80A型旋渦混合器(原上海醫科大學儀器廠);BP110S型電子分析天平(德國Sartorius);MIKRO12��24型高速離心機(德國Hettich);111型真空干燥箱(德國MMM�睪ROUP)。
    1.2 試藥 鹽酸托莫西汀膠囊(每片含托莫西汀10 mg，批號：20080901，有效期至2010年8月，由海南某制藥廠提供);鹽酸托莫西汀對照品(美國Sigma公司，批號：1004-0801002);內標物為鹽酸氟西汀(浙江埃森醫藥有限公司，批號：A0907)。甲醇(默克公司，色譜純);甲酸銨(美國Sigma公司，質譜純);甲酸(迪馬公司，色譜級);碳酸氫鈉(廣州化學試劑廠，分析純);水為重蒸去離子水。

    2 方法與結果
    2.1 對照品和內標溶液 分別精確稱取鹽酸托莫西汀、鹽酸氟西汀對照品11.7 mg和11.4 mg(分別含托莫西汀、氟西汀各10 mg)，分別置10 mL容量瓶中，用流動相溶解定容至刻度，即配制成質量濃度為1 g•L-1的貯備液，貯存于4 ℃冰箱避光保存備用。試驗前按試驗所需稀釋成相應濃度的標準工作液。另稀釋配置質量濃度為3 000 μg•L-1的內標氟西汀流動相溶液。

    2.2 受試者選擇
    試驗前，試驗方案和知情同意書經本院倫理委員會審批同意后，受試者簽署知情同意書，并均進行常規體檢和實驗室檢查(尿常規、血常規、肝功能、腎功能、心電圖和胸透等)，合格者入選為受試者。有15名志愿者簽署知情同意書，經全面體格檢查后，胸透、心電圖、血壓、血尿常規及肝腎功能等各項指標均正常者12名入組，男女各半，年齡為19～27歲，平均(25±4)歲，身高160～178 cm，平均(168±6)cm，體質量50～62 kg，平均(56±6)kg。試驗后，受試者體格復查。受試期間1個月內未服用任何其他藥物，且在1個月內禁煙和禁酒。

    2.3 給藥方案
    12名受試者禁食12 h后，于試驗日早晨7：30空腹開始試驗。受試者一次性口服受試制劑20 mg，用200 mL溫開水送服，服藥4 h后給予統一低脂標準餐。給藥后觀察受試者的反應，記錄受試者主訴的不良反應。

    2.4 血樣采集
    每例受試者均于用藥前在前臂靜脈安置留置針抽血，用藥前采空白血4 mL，再分別于安置留置針給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h分別采血3 mL/次，置肝素抗凝的試管中，3 000 r/min離心5 min，取血漿，分兩份于-30 ℃下冰柜保存，待用。
    整個試驗過程均在醫師和護士監護下進行，并于給藥后不同時間監測受試者的反應，及時處理和記錄試驗過程中發生的不良反應。試驗期間禁用其他藥物及含咖啡因類飲料、煙和酒。

    2.5 樣品測定
    2.5.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(150 mm×2.1 mm，5 μm);流動相：乙腈(含0.2%甲酸)�菜�(含0.02 mol•L-1甲酸銨)(體積比80∶20);流速：0.3 mL•min-1;柱溫：40 ℃。質譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正離子化，掃描方式為選擇性離子監測，托莫西汀m/z 256.1→44.1，氟西汀m/z 310.1→44.2，毛細管電壓4 000 V，噴霧氣壓力206.85 kPa，氣體流速8 L•min-1，氣體溫度350 ℃，碰撞能量8單位，裂解電壓135 V，四級桿捕捉時間0.2 s，電子倍增器300 V。進樣量為5 μL。
    2.5.2 樣品處理 取含藥血漿0.5 mL置10 mL的帶塞磨口錐形玻璃離心管中，加入3 000 μg•L-1的氟西汀甲醇溶液50 μL，快速振蕩3 s，加飽和碳酸氫鈉水溶液0.2 mL，快速振蕩15 s，再加醋酸乙酯�捕�氯甲烷(體積比4∶1)3 mL，密塞，旋渦振蕩1 min，3 000 r•min-1離心10 min，吸取有機層置3 mL的帶塞磨口錐形玻璃離心管內，42 ℃真空至干。進樣前以200 μL流動相復溶，3 500 r•min-1離心10 min，吸取上清液5 μL進樣。   
    2.5.3 方法專屬性 分別取6名受試者的空白血漿0.5 mL 置10 mL的帶塞錐形玻璃離心管中，除不加內標外，按“2.5.2”項依法操作，進樣5 μL，獲得空白血漿樣品的色譜圖，如圖1(A);將一定濃度的對照品溶液和內標溶液加入空白血漿中，依同法操作獲得相應的色譜圖1(B)，托莫西汀、氟西汀的出峰時間分別約為1.24 min和1.26 min;取健康受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得色譜圖1(C)。結果表明，空白血漿中內源性物質不干擾托莫西汀及內標氟西汀的測定。
    2.5.4 標準曲線的制備和最低定量限的確證 取空白血漿0.5 mL，分別加入質量濃度為10、20、50、100、500、1 000、5 000、10 000和15 000 μg•L-1的托莫西汀對照品溶液50 μL，振蕩3 s，使血漿藥物質量濃度分別相當于1、2、5、10、50、100、500、1 000和1 500 μg•L-1，其余按“2.5.2”項處理。經HPLC/MS/MS分析，以托莫西汀峰面積與內標峰面積之比(y)為縱坐標，以血漿托莫西汀濃度與內標濃度之比(x)為橫坐標，權重系數為1/x2，得回歸方程為y=0.5821x-2.5814×10-4，r=0.997 5(n=9)，表明血漿中托莫西汀質量濃度在1～1 500 μg•L-1范圍呈良好的線性關系。血漿樣品托莫西汀定量下限質量濃度為1 μg•L-1(S/N>14)，平行對5個質量濃度為1 μg•L-1的含藥血漿樣品處理后進行色譜分析，其方法回收率為101.82%，RSD為4.96%。
    2.5.5 回收率及精密度試驗 按“2.5.4”項方法分別配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)和高濃度(1 000 g•L-1)的托莫西汀血漿溶液各15份，分為3批，每批5份，并與每批的標準曲線同時進行，依“2.5.2”項方法處理后取5 μL進樣，測定精密度，并計算質控樣品的測得濃度，與配制濃度對照，求得方法回收率(見表1)。同法以空白血漿，除不加標準系列溶液和內標外，按“2.5.2”項方法處理后，再加入相應濃度的托莫西汀和氟西汀，取5 μL上清液進樣，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結果低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高濃度托莫西汀(1 000 μg•L-1)的提取回收率分別為84.78%、85.49%和86.04%。精密度和提取回收率見表1。表1 回收率與日內、日間精密度
    2.5.6 穩定性試驗 按“2.5.4”項方法分別配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高濃度(1 000 μg•L-1)的質控血漿樣品，每個濃度21份樣品分析，分為3組。分別考察了樣品經室溫放置1 h和24 h，凍融1次和3次，-20 ℃凍存1、12、24 d的穩定性。中、高2個濃度樣品3種條件檢測結果的RSD均<15%，低濃度樣品3種條件檢測結果的RSD均<20%。
    2.5.7 質控樣品的監控 按“2.5.4”項方法分別配制低(2 μg•L-1)、中(100 μg•L-1)、高濃度(1 000 μg•L-1)的托莫西汀血漿樣品置-20 ℃凍存備用，此即為血漿質控樣品。檢測每批血漿樣品前需做隨行標準曲線，并隨行檢測質控樣品低、中、高3個濃度，每個濃度至少兩樣本，并應均勻分布在未知樣品測試順序中;結果質控樣品檢測結果其相對標準偏差均在15%內(低濃度在20%)。

    2.6 血漿樣品中藥物質量濃度的測定及藥動學參數的計算
    將12名健康志愿者單劑量給藥20 mg受試制劑和參比制劑后的血藥濃度列表并計算均值和標準差，繪制平均血藥質量濃度�矔r間曲線(見圖2);用DAS程序對數據進行擬合，以實測值計Cmax、Tmax;以末端相血藥濃度的對數值對時間進行回歸，求得斜率K，再求算T1/2;運用梯形法求算AUC0-24和AUC0-∞，主要藥動學參數見表2。將血藥質量濃度�矔r間數據用PKS程序處理，結果平均血藥質量濃度�矔r間曲線符合以權重為1/C擬合的口服給藥二室模型。
 
    2.7 不良反應情況
    12名受試者在試驗過程中，均未出現不良反應，試驗后進行體格復查，胸透、心電圖、血壓、血尿常規及肝腎功能等各項指標均正常。表2 12名健康志愿者給藥后的主要藥動學參數

    3 討論
    人血漿中托莫西汀濃度檢測方法國內外未見文獻報道。本文曾采用醋酸乙酯、乙醚、三氯甲烷、正己烷以及醋酸乙酯�捕�氯甲烷(體積比4∶1)作為提取液，通過比較發現醋酸乙酯�捕�氯甲烷(體積比4∶1)混合提取液提取率最高，雜質也較少，故采用此混合提取液。本文建立的串聯質譜檢測方法，定量檢測限達到1 μg•L-1，滿足人體藥動學研究要求。
    鹽酸托莫西汀膠囊人體藥動學研究未見國內文獻報道。單次口服20 mg后T1/2約為4.55 h，Cmax約為225.18 μg•L-1，Tmax為1.33 h，個體差異大，可能與CYP2D6存在個體差異有關，與文獻[1-3]報道相似，用藥時應引起醫生注意。

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