摘　要:目的對胸腺肽α1 的固相合成工藝進行研究,并對合成產物進行活性評價。方法采用對堿敏感的Nα2芴甲氧羰基(Fmoc) 作為α2氨基的保護基,以Fmoc2Asn(Trt)2Wang Resin 為起點,逐個延伸固相合成法合成胸腺肽α1 。與Nα2Fmoc2基團配套的保護策略還有:叔丁氧羰基(Boc) 保護Lys 的側鏈氨基,叔丁酯基(OtBu) 保護Asp 、Glu 的側鏈羧基,叔丁氧基( tBu) 保護Ser、Thr 的側鏈羥基,三苯甲基(Trt) 保護Asn 的側鏈酰胺基。。采用DCC2HOBt 縮合劑法進行接肽反應,茚三酮定性顯色法和水楊醛定量自由氨基檢測法控制反應進程,肽段最后用TFA2DCM( V∶V = 1∶1) 定量地從樹脂上切除。結果胸腺肽α1 總產率為3312 %。 純化后的產物,經SDS2PAGE 和RP2HPLC 鑒定,純度為98.8 %以上,活性與日達仙對照品相當。結論Nα2芴甲氧羰基保護策略的固相合成方法操作簡便、條件溫和、副反應少,產品純度高、收率高。

 

    關鍵詞:藥物化學;制備;固相多肽合成;胸腺肽α1 ;Nα2芴甲氧羰基(Fmoc)

 

    中圖分類號:R914 ;R965 　　　文獻標識碼:A

 

    胸腺肽α1 (Tα1) 是一種新型免疫調節因子,它通過誘導干細胞轉化為成熟T 淋巴細胞,刺激淋巴系統,提高機體免疫功能[1 ] ,臨床上應用Tα1提高T 細胞的免疫功能,治療病毒性肝炎[2 ,3 ]和延緩某些老年病的發生與發展。Tα1 還有抗感染、抗病毒和抗腫瘤[4 ]的功效,尤其對癌癥的免疫性治療也具有一定的作用[5 ,6 ] 。 組織提取Tα1 受材料來源限制,工作量大、成本高;利用基因重組方法,小分子肽的表達比較困難,而且產率較低。 本研究采用新型保護策略的固相合成方法,擬建立一條操作簡單、易于放大的化學合成路線,為Tα1 的批量生產和廣泛臨床應用奠定基礎。

 

1 　實驗部分

    所有Fmoc 保護氨基酸、Fmoc-Asn ( Trt)-WangResin、HOBt (1-羥基苯并三唑) 由美國ACT 公司提供,樹脂取代值為015 mmol/ g。TFA、ConA 購自Sigma 公司。1640 培養液購自Gibco 公司。DCC(二環己基碳二亞胺) 及其他試劑為國產分析純(AR) 。Tα1 對照品日達仙( Zadaxin) 為美國Sci-Clone 公司產品。手動固相多肽合成儀(自制) 。Laborota 4002/ WB 旋轉蒸發儀( Heidolph , Ger-many) ,HP 1100 分析型高效液相色譜儀(美國惠普公司) , GradiFrac 色譜儀( Pharmacia ,瑞典) ,WatersPrep LC 4000 System 制備型高效液相色譜儀,Hi-tachi L - 8500 型氨基酸分析儀。

 

1.1 　Tα1 的全合成

    起始Fmoc-Asn ( Trt)-Wang Resin 按多肽順序由C 端逐個向N 端延伸,各種Fmoc 保護氨基酸的側鏈保護基分別為Thr ( tBu) 、Ser ( tBu) 、Asp(OtBu) 、Glu (OtBu) 、Lys (Boc) ,縮合劑為DCC ,并加HOBt 以活化氨基酸的羧基,每輪循環用體積分數為50 %的哌啶去除Fmoc ,肽鏈合成后,N 端乙酰化,最后用TFA 將肽從樹脂上切割并去除所有保護基團。采用茚三酮定性顯色法(Kaiser 法)和水楊醛定量自由氨基檢測法對Tα1 合成過程進行監測。

 

1.1.1 　脫除Fmoc 氨基保護

    Fmoc2Asn (Trt)2Resin 110 g 以二氯甲烷(DCM)10 mL 浸泡后洗滌2 min ×3 ,抽干,加入哌啶2DCM(V∶V = 1∶1) 10 mL ,反應5 min ,抽干,再以同樣的量處理一次,反應30 min ,反應在室溫下進行,抽干后依次以DCM、EtOH、DCM (8～10 mL) 洗滌、抽干,取少量樹脂(2～10 mg) 測定總氨基量(mmol/ g樹脂) 。

 

1.1.2 　肽鍵的形成

    將上述樹脂浸泡洗滌后抽干,加入425.5 mgFmoc2Glu(OBut )2OH 的DCM 溶液1.5 mL、76.6 mgHOBt 的DCM 溶液1.0 mL (加數滴DMF 溶液助溶) ,預平衡30 min ,加入含有206.3 mg DCC 的DCM溶液2.0 mL ,20 ℃反應過夜,抽干,洗滌,取少量樹脂干燥至恒重,測定其殘余氨基,計算縮合率。

 

1.1.3 　氨基末端乙酰化

    脫除多肽鏈最末端氨基酸的保護基后,再用10 mL醋酐2吡啶( V∶V = 1∶1) 于室溫下處理樹脂30 min ,洗滌、抽干,再以同樣的量處理2 h ,使氨基末端乙酰化。

 

1.1.4 　脫除側鏈保護及肽鏈下樹脂

    在裝有全保護二十八肽樹脂的反應瓶中,加入3.0 mL DCM、3.0 mL TFA ,25 ℃反應60 min ,過濾,再加入TFA2DCM( V ∶V = 1∶1) 10 mL 反應20min ,樹脂用TFA2DCM( V∶V = 1∶1) 洗3 次,合并濾液,濾液經旋轉蒸發儀蒸發至最小體積,加入大量無水Et2O ,析出白色粉末狀物體,離心沉淀,用無水Et2O 研磨5 次,真空干燥得白色固體粉末(粗產品) 1.263 g(理論產值為1.554 g) 。

 

1.2 　Tα1 的分析與純化

    目標肽粗品先經DEAE Sepharose Fast Flow 離子交換色譜純化(pH = 8.0 的Tris2HCl 為緩沖液,離子強度為0～0.35 mol/ L NaCl 溶液進行線形梯度洗脫) ,部分收集后進行制備型RP2HPLC 純化,采用C18 (Radial Pak ,100 mm ×8 mm id ,5μm ,100! ) 色譜柱,流動相A 為TFA2H2O( V∶V = 1∶999) ,流動相B 為流動相A2CH3CN( V∶V = 1∶9) ,線形梯度為10 %～35 %(φ) B ,60 min ,流速210 mL/ min ,檢測波長2.4 nm。在相同的RP2HPLC 條件下,粗品譜圖中極大峰的保留時間22.039 min ,與對照品日達仙色譜峰的保留時間22.084 min 基本一致。粗品肽經過二步純化后,采用RP2HPLC 分析為單峰,保留時間為22.04 min。Tricine2SDS2PAGE[7 ]電泳檢測結果表明:合成的粗品Tα1 與日達仙對應位置有單一條帶,電泳掃描結果顯示目標肽純度為98.8 % ,合成總收率為33.2 %。氨基酸組成分析結果與理論值相等。

 

1.3 　體外活性測定

    采用3H2TdR 摻入法[8 ]測定Tα1細胞對小鼠淋巴細胞增殖活性。取小鼠脾臟在鋼篩上研磨后用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,用PBS 洗后,懸于含10 %(φ) 小牛血清的1640 培養液中,向96 孔培養板中加入脾細胞4 ×105/ 孔和5 mg/ L 終濃度的ConA。每組3 個復孔, 并設對照組。37 ℃,體積分數為5 %的CO2 條件下培養6 h ,再加入不同濃度的日達仙和合成的Tα1 ,繼續培養66h ,每孔加入3H2TdR 18.5 ×10 - 3GBq ,培養6 h ,收集細胞于玻璃纖維濾紙上,晾干后用液閃記數儀檢測每分鐘脈沖數值,計算增殖率。結果表明,合成的Tα1 與對照品日達仙相比無差異。

 

2 　討論

    采用Fmoc 固相方法合成Tα1 ,粗肽經過純化和分析得到預期活性產物。合成中,選用m2二乙烯苯交聯的聚苯乙烯樹脂為固相載體,從膨脹性和穩定性考慮1 %交聯度較為合適。由于與樹脂相連的肽的C 末端氨基酸為酰胺類型,故選用Wang 法制備對芐氧苯甲醇(HMP) 功能化樹脂。在固相多肽合成中,氨基與側鏈保護系統采用“正交保護法”,用機制完全不同的反應來選擇性地斷裂不同的鍵,體現了一種氨基保護和側鏈保護相匹配的原則,即用新型的堿易裂解型保護基Fmoc保護α2氨基,用酸易裂解型保護基Boc 等保護側鏈。而經典的固相多肽合成是用酸易裂解型保護基Boc 保護α2氨基。Fmoc 法用TFA 切除樹脂和脫除側鏈保護基,操作簡便、條件溫和,避免了Boc 法中強酸處理所帶來的危險性和諸多副反應,既提高了反應的選擇性,又使操作簡單、安全,更易實現自動化。該工藝以Fmoc2Asn ( Trt)2Wang Resin 為合成起點,將Tα1 的羧端固定在二乙烯苯和苯乙烯共聚樹脂上,向氨基端逐步遞加、延長肽鏈,每一步反應較易進行,消旋化的可能性小,但要求每步反應都應達到高產率,本工藝每步反應的縮合率為98.7 %。目標肽的粗品經離子交換色譜和制備型高效液相色譜分離后,SDS2PAGE 電泳分析為單一條帶的產物,其氨基酸組成分析與理論值相等。由于多肽是用固相法合成,氨基酸的連接順序固定,證明了合成Tα1 結構的正確。Tα1 是酸性很強的二十八肽,相對分子質量為3 108 ,等電點為4.2 ,N 端被乙酰化,含有大量的Asp 、Glu ,不含有甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香氨基酸,氨基酸序列為:Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。其活性較已經開發上市的胸腺肽組分F5 提高10～1 000 倍。生物活性測定表明:Tα1 具有良好的免疫刺激活性,且與國外對照品日達仙有相當的劑量效應。目標肽Tα1 確有提高免疫功能低下動物的免疫能力,促進淋巴細胞增殖、成熟的作用。這將為進一步研究Tα1 的免疫調節機制及探討其臨床應用提供參考,特別對免疫調節劑配伍細胞因子的研究奠定基礎。

 

參考文獻:

[1 ] 　Li Chunlin , Zhang Ting , Saibara Toshiji , et al . Thymosinalpha 1 accelerates restoration of T cell-mediated neutral-izingantibody response in immunocompromised hosts [J ] .Int Immunopharmacol ,2002 ,2(1) :39 - 46.

[2 ] 　Lau GK,Nanji A ,Hou J , et al . Thymosin-alpha 1 and fam-ciclovir combination therapy activities T-cell response inpatients with chronic hepatitis B virus infection in immune-tolerant phase[J ] . J Viral Hepat ,2002 ,9(4) :280 - 287.

[3 ] 　Andreone P ,Cursaro C ,Gramenzi A , et al . In vitro effectof thymosin-alpha 1 and interferon-alpha on Th1 and Th2cytokine synthesis in patients with chronic hepatitis C[J ] .J Viral Hepat ,2001 ,8(3) :194 - 201.

[4 ] 　Shrivastava P ,Singh SM,Singh N. Effect of thymosin-al-pha1 on the production of nitric oxide by tumor-associatedmacrophages[J ] . Neoplasma ,2003 ,50(1) :47 - 53.

[5 ] 　Rasi G,Terzoli E , Izzo F , et al . Combined treatment withthymosin-alpha 1 and low dose interferon-alpha after
dacarbazine in advanced melanoma [ J ] . Melanoma Res ,2000 ,10(2) :189 - 192.

[6 ] 　Mitani M,Kuwabara Y,Kawamura H ,et al . Significance ofplasma thymosin alpha 1 measurements in gastric cancerpatients[J ] .World J Surg ,2000 ,24(4) :455 - 458.

[7 ] 　Shi Jihong ,Zhao Yongtong ,Zhang Yingqi , et al . Study onanalysing methods of low molecular peptides with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [ J ] . Prog Biotechnol ,2001 ,21(1) :38 - 41.

[8 ] 　Shi Jihong ,Zhang Yingqi ,Zhao Yongtong , et al . Cloning ,expression of thymosin alpha 1 gene in E. coli and its pu2rification and characterization [ J ] . Chin J Biochem MolBio ,2001 ,17(3) :344 - 349.

Study on Fmoc solid2phase synthesis andactivity of thymosin α1

HAN Xiang ,GU Jun ,YUAN Qing2lan ,GAN Yi2ru
( Department of Chemistry , Medical College of Chinese People′s Armed
Police Forces , Tianjin 300162 , China)

Abstract :Aim To synthesize thymosin α1 by the solid2phase method. Methods Peptide synthesis was performed manually by the stepwise solid2phase method using the base2labile Fmoc group for protecting the α2amino acid. The peptide was assembled on a p2alkoxybenzyl alcohol resin.And the peptide sequence was prepared employing Fmoc2 amino acid and Boc2protected Lys ,OtBu2protected Asp ,Glu , tBu2protected Ser ,Thr ,Trt2protected Asn as building blocks. The Fmoc group was removed with piperidine2DCM( V∶V = 1∶1) . The peptide resin was treated with TFA2 DCM( V∶V = 1∶1) ,and purified by ion2exchange chromatography and prepared RP2HPLC. The analytical strategies included the reaction of ninhydrin reagents with small samples of resin peptide and salicylaldehyde reagents testing methods were used to monitor solid2phase reactions and determine the structures of resin2bound compounds. Results The yield of the total synthesis was 3312 % ,based on the amino acid content of the starting Fmoc2Asn (Trt)2resin. The purity was range to above 9818 % ,the activity is equal to that of Zadaxin. Conclusion A strategy for the synthe2 sis of thymosin α1 was presented. This orthogonal protection strategy has bright prospects for peptide synthesis. Key words :medicinal chemistry ;preparation ;solid2phase peptide synthesis ;thymosin α1 ;Fmoc