許　波,楊　軍　　(第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院口腔科,重慶400038)

 

　　三叉神經(jīng)損傷臨床較為常見,本研究通過建立動物模型,探討外源性NGF 對三叉神經(jīng)下頜支損傷后感覺神經(jīng)元細胞凋亡及凋亡相關因子Bcl22 及Bax 的影響,以期尋求一種更為理想的周圍神經(jīng)缺損的修復方法提供理論依據(jù)。

 

1. 1 　動物分組及模型建立

　　健康雄性成年Wistar 大鼠120 只,體重250～300 g(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供) 。分為三大組,每組6 只,正常對照組, 左側(cè)三叉神經(jīng)下頜支離斷后單純吻合組,左側(cè)三叉神經(jīng)下頜支離斷后吻合+ NGF 組(NGF組) 。

　　大鼠經(jīng)1 %戊巴比妥鈉(50～60 mg/ kg) 腹腔注射麻醉后,備皮、消毒,切開左側(cè)下頜下緣皮膚、肌肉,骨膜,掀起頰側(cè)軟組織瓣,顯露下頜骨,找出下齒槽神經(jīng)血管束。去除下頜骨下1/ 3頰側(cè)骨板,顯露下齒槽神經(jīng)血管。在手術顯微鏡下,仔細分離下齒槽神經(jīng)。自頦孔向后約6 mm 處切去下齒槽神經(jīng)6 mm ,任其回縮。神經(jīng)離斷后0、3、7 d 用14 mm長的硅膠管(內(nèi)徑115mm ,外徑210 mm) 橋接,9 個0 無損傷尼龍線穿過神經(jīng)斷端外膜,兩端分別套入管內(nèi)2 mm并固定于管壁上,對左側(cè)下齒槽神經(jīng)造成10 mm缺損。同時管內(nèi)注射NGF(中國軍事醫(yī)學科學院

基礎醫(yī)學研究所提供) 溶液(1 mg/ L) 30μl 或等量的生理鹽水。術后分別飼養(yǎng)15 d ,30 d。各組動物飼養(yǎng)至所需時間后用4 %的多聚甲醛灌注取材。

1. 2 　取材、固定、初步處理及切片

　　方法參照文獻[1 ] ,取材于三叉N 感覺核區(qū),沿大腦腳蓋中部靠外側(cè)(前囟后9168 mm ,中線旁0168 mm) ,行冰凍冠狀連續(xù)切片(10μm) ,切片置于- 20 ℃冰箱中保存以備用。

1. 3 　觀察方法

1. 3. 1 　原位末端標記法(Terminal deoxycleotidy12transferase2medi2ated dUTP2biotin nick end labeling TUNEL) 標記凋亡細胞　　

TUNEL 法試劑盒購至博士德公司(MK 1 020) ,操作參照說明書進行,在×100 普通光鏡下觀察感覺核區(qū)內(nèi)TUNEL 陽性細胞形態(tài)。

1. 3. 2 　免疫細胞化學法檢測凋亡相關因子Bcl22 及Bax 　　免疫細胞化學法檢測試劑盒購至博士德公司(MK 1 102) ,操作參照說明書進行,在×100 倍普通光鏡下觀察感覺核區(qū)內(nèi)Bcl22、Bax 表達。

1. 3. 3 　圖像分析及統(tǒng)計學分析　　取各實驗組不同時相點感覺核區(qū)內(nèi)陽性細胞數(shù)量進行統(tǒng)計,比較各組TUNEL 陽性細胞數(shù)量以及Bcl22、Bax 表達量的差異。數(shù)據(jù)采用方差分析。

 

2. 1 　NGF 對凋亡細胞數(shù)量的影響

　　凋亡的神經(jīng)元細胞經(jīng)TUNEL 法染色胞核呈黃褐色,從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。細胞核中有棕黃色顆粒,胞質(zhì)不著色者為陽性細胞(凋亡細胞) 。軟件圖像灰度比分析結(jié)果顯示,與正常對照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經(jīng)元凋亡數(shù)都明顯增加,但0 d、3 d 吻合的NGF 組凋亡數(shù)明顯少于單純吻合組( P < 0101) ,而7 d 吻合NGF 組細胞凋亡數(shù)與單純吻合組無明顯差異( P > 0105) 。

2. 2 　NGF 對Bcl22 及Bax 的影響

　　免疫細胞化學顯示,Bcl22 及Bax 在正常成年大鼠三叉神經(jīng)感覺神經(jīng)元中表達很低,僅見少量免疫反應可疑陽性細胞,細胞著色很淡。與正常對照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經(jīng)元細胞Bcl22 及Bax 的表達不同程度地增高,NGF 組中Bcl22的表達明顯高于單純吻合組( P < 0101) 而單純吻合組中Bax 的表達明顯高于NGF 組( P < 0101) 。

 

　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,神經(jīng)損傷所導致的神經(jīng)元變性和壞死可引起軸突再生的失敗,這可能與損傷引起的神經(jīng)元凋亡有關。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子(NGF) 與神經(jīng)細胞凋亡的關系十分密切[2 ] ,其生物學作用不僅表現(xiàn)在可阻止神經(jīng)元發(fā)育過程中凋亡的發(fā)生,同時對調(diào)節(jié)神經(jīng)元的連接也有重要的作用。但是關于NGF 對三叉神經(jīng)損傷后感覺神經(jīng)元細胞的凋亡是否具有抑制作用目前尚未見報道。

　　本研究發(fā)現(xiàn)NGF 可以抑制損傷后三叉神經(jīng)感覺核神經(jīng)元細胞的凋亡,結(jié)果同時顯示,7 d 吻合加NGF 組與單純吻合組的神經(jīng)元凋亡數(shù)無明顯差異,提示神經(jīng)損傷后盡快恢復神經(jīng)的連續(xù)性及軸漿運輸通道是十分必要的。

　　人們在凋亡的分子生物學研究中還發(fā)現(xiàn),凋亡與胞核內(nèi)某些基因有關,Bcl22 家族是研究較早的與凋亡有關的基因。B 細胞淋巴瘤/ 白血病22 (B2cell lymphoma/ leukemia22 , Bcl22) 中有的稱為抑凋亡基因,如Bcl22 ;有的則稱為促凋亡基因,如Bax。這些基因家族成員自身或彼此之間形成二聚體/ 多聚體。Bcl22家族的蛋白2蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡,核心是Bcl22 與Bax 的相互作用[3 ] 。有實驗表明[4 ] ,在節(jié)狀神經(jīng)元中Bcl22 的抗凋亡效應完全依賴Bax 的存在;而在三叉神經(jīng)元中Bcl22 的抗凋亡效應并不依賴Bax 的存在,從而說明Bcl22 的抗凋亡效應或是通過抑制其他促凋亡蛋白來發(fā)揮或是由Bcl22 直接抑制死亡效應蛋白所致。本實驗結(jié)果表明三叉神經(jīng)損傷后,局部給予外源性NGF 可使抗凋亡基因Bcl22 和促凋亡基因Bax均增加,但Bcl22 更加顯著,這樣Bcl22 與Bax 的相對比例增加,從而抑制凋亡,這與有的學者研究結(jié)果一致。

　　綜上所述,本實驗結(jié)果顯示,三叉神經(jīng)下頜支損傷后,在盡早恢復神經(jīng)的連續(xù)性的同時局部早期予以外源性NGF ,可更加明顯地減少神經(jīng)元的凋亡,有效地促進神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能的恢復。但目前關于NGF 調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡機制尚未完全闡明,還有許多未知調(diào)控因素以及相關基因?qū)�細胞凋亡的調(diào)控機制有待于進一步深入研究。

 

 

參考文獻:

[1 ] 蔡文琴,王伯氵云主編. 實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術[M] . 成都:四川科學技術出版社,1992. 128.

[ 2 ] Derby A , Engleman V W, Frierdich G E , et al . Nerve growth factor facili2tates regeneration across nerve gaps : morphological and behavioral studies inrat sciatic nerve[J ] . Exp Neurol ,1993 ,119 (11) :176 - 191.

[3 ] Merry E , Korsmeyer SJ . Bcl22 gene family in the nervous system[J ] . An2nu Rev Neurosci ,1997 ,20 (3) :245 - 257.

[4 ] LindenboimL , Yuan J , Stein R. Bcl2xS and Bax induce different apoptoticpathways in PC12 cells[J ] . Oncogene ,2000 ,19(14) :1 783 - 1 793.

(編輯　陳聰連)