替諾福韋酯耐藥可能相關突變分析

1740例慢性乙型肝炎患者替諾福韋酯耐藥可能相關突變分析

梁兆玲劉 妍蘇何玲 孟玉華 羅莉蓉 王靜戴久增姚增濤徐東平
解放軍傳染病研究所 北京 100039

    1．1研究對象2007年7月一2008年3月在解放軍第三。二醫院就診和治療的患者1 740例，男1 47 l例，女269例，年齡(37．2±13．6)歲，診斷符合我國2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》I慢性病毒性肝炎診斷標準，絕大多數患者接受過核苷(酸)類似物抗HBV治療，但均未應用過替諾福韋酯（TDF）。收集患者血清用于檢測。
 
    1．2 HBV RT基因擴增 病毒DNA提取采用天澤基因工程有限公司生產的病毒DNAout試劑，HBVRT基因擴增采用我們建立的巢式PCR方法 

    1．3序列分析PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定和同收純化后，用ABl3730xl基兇分析儀進行雙向DNA序列測定。用Vector NTI軟件對序列測定結果進行分析，檢測了與抗HBV核苷(酸)類似物耐藥相關的RT區12個位點序列(173、180、181、184、194、202、204、214、215、217、233、250)，對各個位點的序列峰圖依次進行分析，與參考序列比對，分析是否存在插入或缺失突變，重點分析了與替諾福韋酯（TDF）耐藥可能相關的A194T、V214A、Q215s以及A181V+N236嘴突變。當同—位點同時檢出突變與未突變(野生)序列、且每種序列均達到總峰值的25％(即每種序列所占比例(≥20％)時，報告為突變，未突變序列共存，仍計入突變。 

    2結果 
    2．1與LAM等四種核苷(酸)類似物耐藥相關突變檢測分析在1 740例受檢的CHB患者中，540例(31．0％)檢出各種形式的核苷(酸)類似物耐藥相關突變，其中LAM耐藥相關突變345例，占63．9％，主要突變形式依次為(V173L)+L180M+M204Ⅳ(120例)、M204I(92例)、(V173L)+L180M+M204I(79例)、(V173L)+L180M+M204V／I(3l例)。ADV耐藥相關突變96例，占17．2％，主要突變形式依次為A181V或A181T或A181T／V+N236T(20例)、V214A(18例)、N236T(17例)、A18IV(13例)。En耐藥相關突變20例，占3．7％，主要突變形式為T184L或其他氨基酸(14例)，同時伴有LAM耐藥相關突變。LdT耐藥相關突變14例，占2．6％，主要突變形式為(L180M)+M204I(9例)。ADV+LAM聯合耐藥突變54例，占10．o％；ADV+ETV耐藥相關突變11例，占2．0％。 

    2．2與替諾福韋酯耐藥可能相關的突變分析 未檢mA194T突變；V214A單點突變檢出34例(2．o％)，其中單獨fn現3l例，與180M+M204V同時…現l例，與L180M+M2041同時m現2例；Q215s單點突變檢出3例(0．2％)，其中l例與Q215P突變共存。此外，9例患者在Q215位點檢出其他突變，包括Q215H 7例、Q215P和Q215E各1例。突變基因的代表』生測序峰圖見圖l。檢m A181V+N236T突變12例，A181WT+N236T突變3例，均為ADV耐藥患者。 

    3討論 
    核苷(酸)類似物由于具有起效迅速、服用方便、不良反應小等優點容易被患者接受，作為抗HBV治療的主要藥物在臨床上得到廣泛使用。日前使用的四種藥物LAM、ADV、ETV和LdT作用的靶位均為HBV的RT基因。早期使用的核苷(酸)類似物具有較高的突變耐藥率，其中第一個上市的LAM 5年耐藥突變發生率為70％，第二個上市的ADV 5年耐藥突變發生率為29％f161。雖然近年上市的ETV和IAT對核苷類似物初治患者的耐藥突變發生率不高，但對已有LAM耐藥突變基礎的患者由于基因屏障明顯降低，突變發生率顯著增高，其中ETV的3年耐藥突變發生率為17％～32％，LdT的1年耐藥突變發生率為7％～8％tt6l。臨床上對二種或二種以上核苷(酸)類似物產生交叉耐藥的CHB患者愈來愈多見，這些患者的抗病毒治療較為困難，目前常聯合使用一種核苷類似物(LAM、ETV或LdT)和一種核苷酸類似物(如ADV)控制耐藥病毒復制，但由于ADV安全劑量較低，且在A181位點上的耐藥突變與LAM耐藥交叉，影響了其臨床療效。

    我們對1 740例CHB患者血清HBV RT基因進行了序歹Ⅱ測定，根據上述文獻資料，重點對CHB患者可能與TDF耐藥相關的A194T以及可顯著降低TDF藥敏的V214A、Q215s和A181V+N234T進行了分析。共540例患者檢出與核苷(酸)類似物耐藥相關的突變，但未檢測到A194T突變。檢出了34例V214A突變、2例Q215S突變和15例A181V(或A18lV，I．)+N236T突變，如前所述，與TDF的耐藥相關性還有待進一步明確。A181V+N236T是公認的ADV耐藥突變株，對ADV的抗性強于其他形式的ADV突變株；V214A和Q215S兩種突變株與ADV耐藥相關性則存有爭議閉，我們雖然從一些ADV耐藥患者中檢出了V214A突變，但也從多例未曾接受過ADV治療的患者中檢出了該突變，推測該突變對ADV耐藥的影響相對有限。除3例Q215S突變外，我們還檢出了9例其他形式的Q215突變，但這些突變與TDF耐藥的相關性還未見報道。確定一種突變是否與耐藥相關，應具備以下特征：①與使用治療藥物有關；②臨床上出現病毒反彈和／或病情反復；③體外實驗能證明變異病毒對治療藥物的敏感性降低；④可能出現在多個病例；⑤停藥后病毒有可能恢復為野生型12-I。為此，對這些突變的臨床意義還有待進一步確證�？傊�，我們通過對大樣本CHB患者血清HBV RT基因的測序分析表明，未檢出與TDF臨床耐藥可能相關的A194T突變，提示自然發生或應用LAM、ADV、ETv和uT后，由病毒基因突變引起TDF原發耐藥的可能陛很小，預測該藥在我國對治療目前四種抗HBV核苷(酸)類似物耐藥的患者應具有較好療效；同時提示應當關注V214A和A181V+N236T突變可能對TDF臨床療效產生的負面影響。

    本文節選自：《傳染病信息》 2009年第22卷第4期  梁兆玲劉 妍蘇何玲 孟玉華 羅莉蓉 王靜戴久增姚增濤徐東平 解放軍傳染病研究所 北京 100039  《1740例慢性乙型肝炎患者替諾福韋酯耐藥可能相關突變分析》

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