沙眼衣原體感染與精子凋亡關系

　　男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在癥狀或非癥狀男性生殖道感染中，起關鍵作用的兩種生物體是解脲支原體(mycoplasma urealytium;MU)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis;CT)。近年來，關于MU感染與男性不育的關系已有大量的報道，但CT感染對精子及男性不育的影響報道不多[1～3]， CT感染引起男性不育的機制仍不清楚。據(jù)WHO報道，每年全球約5億人新發(fā)性傳播疾病，其中的18％是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年輕、性活躍者是生殖道CT感染的好發(fā)人群，在CT的傳播中具有重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易確定，其原因是CT感染不易作微生物學檢查或為無癥狀者。細胞凋亡（apoptosis）是細胞在胞外或胞內(nèi)信號誘導下發(fā)生的主動自殺死亡過程，是調(diào)控機體發(fā)育、維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細胞主動死亡過程。關于精子凋亡與男性不育的關系已有報道[6]。為明確CT感染引起男性不育的機制，于2007年對精液CT感染與精子凋亡之間的關系進行了探索。

　　目的： 探討精液沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)感染與精子凋亡的關系，為研究男性不育提供新思路。

　　方法： 沙眼衣原體的檢測用免疫層析法，采用瑞－姬染色精子，觀察精子形態(tài)變化；用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）介導的脫氧核苷酸原位末端標記法（TUNEL）檢測凋亡精子。

　　結果： 精液CT陽性組精子凋亡率（33.03±14.98）％，正常對照組精子凋亡率為（9.68±2.78）％，組間差異顯著（P＜0.01）。

　　結論： 精液CT感染導致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究對象

　　正常對照組15例，有正常生育史，身體健康，精液CT檢測陰性，精液常規(guī)正常的自愿捐精子者；年齡24～32歲，平均（27.73±2.20）歲。CT陽性組57例，不育門診就診者，為婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睪丸、附睪、內(nèi)分泌、染色體等檢查無異常；精液CT檢測陽性，年齡24～40歲，平均（28.81±3.31）歲，不育年限2～10年，平均（4.37±2.70）年，其配偶檢查無異常。

　　1.2 試劑

　　TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒由南京凱基生物技術有限公司提供，CT快速免疫檢測試劑盒由英國Unipath公司提供，1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供，percoll原液由南京凱基生物技術有限公司提供，TritonX��100由北京拜爾迪生物公司提供。

　　1.3 研究方法

　　所有研究對象均禁欲3～5 d，手淫法收集全程精液于無菌玻璃容器中，置于35 ℃恒溫恒濕箱中液化。取液化后的精液2 ml加入底部有2 ml 45%Percoll液的離心管中，2 000 r/min離心10 min，精液細胞主要沉積于精漿和45％Percoll液之間，于精漿與45％Percoll液之間用移液器取50 μl×5次精液沉淀入另一組離心管中，加入2 ml生理鹽水，充分混勻；1 500 r/min離心10 min棄上清液，加入生理鹽水2 ml；充分混勻后，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入生理鹽水2 ml；充分混勻后，1 500 r/min，離心10 min棄上清液，加入3 ml生理鹽水，充分混勻，配成一定濃度的細胞懸液。取制備好的精液細胞懸液50 μl分別滴加在普通潔凈的玻片（瑞姬染色用）和多聚賴氨酸防脫玻片（TUNEL時用）上，用采血針推平，棄去多余的細胞懸液，平放、自然涼干。

　　1.4 CT檢測

　　取液化后的精液1～2 ml，1 500r /min離心10 min，取沉淀，按照試劑盒說明書進行操作。

　　1.5 常規(guī)形態(tài)學染色

　　取制備好的普通玻片精液細胞樣本，浸入瑞－姬染液中1 min，倒入等量pH6.9的PBS緩沖液，再染10 min，自來水沖洗，自然涼干后用光學樹脂封片，置油鏡下檢查并拍照。

　　1.6 TdT介導的TUNEL法檢測凋亡精子

　　取已制備好的多聚賴氨酸防脫玻片精液細胞樣本浸入固定液，室溫15～25 ℃固定15 min～1 h；-20 ℃的乙醇中放置2 h；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入封閉液，室溫15～25 ℃封閉10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入通透液中，冰上（2～8 ℃）促滲2 min。PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干；每個樣本滴加50 μl TdT酶反應液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤反應 60 min；PBS漂洗3次，樣本周圍用吸水紙吸干；滴加50 μl Streptavidin�睭RP�补ぷ饕海�加蓋玻片37 ℃濕潤避光反應30 min；PBS漂洗3次；滴加50 μl DAB工作液，室溫顯色反應10 min；PBS漂洗3次，光學顯微鏡下檢測及拍照。

　　1.7 統(tǒng)計學處理

　　采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗，結果用（x±s）表示。

　　2 結 果

　　2.1 精子周亡率

　　觀察精子頭尾部，計數(shù)凋亡精子，統(tǒng)計凋亡率（計數(shù)500個精子，計算凋亡精子數(shù)占總精子數(shù)的比例），正常對照組精子凋亡率為（9.68±2.78）％，CT陽性組精子凋亡率達到（33.03±14.98）％。

　　2.2 TdT介導的TUNEL法檢查凋亡精子

　　隨機觀察正常對照組和CT陽性組精液標本，凋亡精子頭部呈棕黃色（圖1～4)，未凋亡精子不著色。

　　2.3 瑞－姬染色檢查凋亡精子 凋亡精子染色質(zhì)固縮（圖5），核邊集、呈新月狀或塊狀小體（圖6）。

　　3 討論

　　CT是一類專性細胞內(nèi)生長、有獨特發(fā)育周期的原核細胞型微生物，很少從正常男性尿道中分離出來，但被認為是非淋菌性尿道炎（NGH）、附睪炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，其對男性生育功能的影響已引起了人們的關注。研究結果顯示，CT陽性組和正常對照組精子凋亡率分別為（33.03±14.98）％和（9.68±2.78）％，組間差異顯著，表明精液CT感染導致精子凋亡率增加。CT感染可刺激巨噬細胞分泌IL��1、LI��6及TNF��α等細胞因子[7，8]，而TNF��α是啟動細胞凋亡的重要細胞因子；同時，TNF��α增高后使轉移單電子的還原型輔 圖1 CT陽性組少精子組（TUNEL法，酶Ⅱ氧化酶含量增多，產(chǎn)生一系列的活性氧化物質(zhì)（ROS）。過量的ROS，一方面可使精子線粒體內(nèi)、外膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，使膜的脂質(zhì)排列松散，內(nèi)膜脊減少，ATP合成降低；另一方面過量ROS還可引起精子核的DNA發(fā)生斷裂，導致精子凋亡的增加。Darville等[9]研究小鼠生殖道抗CT感染機制，發(fā)現(xiàn)在抗CT感染的宿主免疫應答中存在細胞介導免疫。Spadafora[10]研究證實生精細胞通過CD4分子介導免疫后，具有自發(fā)攝取外源性DNA能力，精子與外源性DNA相互作用，刺激內(nèi)源性核酸導致類似凋亡的細胞死亡過程。

　　細胞凋亡(apoptosis)是多細胞生物普遍存在的細胞死亡形式之一。有研究顯示，在生長發(fā)育、組織代謝和一些疾病等許多生理和病理過程中，凋亡都發(fā)揮著極為重要的作用。目前檢測凋亡的方法很多,其中原位末端標記技術TUNEL法是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞或凋亡小體進行原位染色,能準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。DNA裂解為許多單或寡核苷酸片斷是細胞凋亡的主要生化標志。由于正常的、或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，故很少能夠被染色[11]。應用TdT介導的TUNEL法檢測正常對照組和CT陽性組精液標本，凋亡精子呈棕黃色，而未凋亡精子不著色。在應用TdT介導的TUNEL法檢測凋亡精子的同時，應用常規(guī)瑞－姬氏染色法從另一角度檢測凋亡精子，發(fā)現(xiàn)凋亡精子核染色質(zhì)固縮并核周聚集，呈境界分明的新月形或塊狀小體；胞質(zhì)起泡，胞質(zhì)嗜酸性增強等形態(tài)結構改變，與熊承良等[12]報道一致。萬長春等[13]研究表明，由于常規(guī)形態(tài)學方法不能早期發(fā)現(xiàn)凋亡細胞核與細胞器的改變, 故凋亡細胞百分率常規(guī)形態(tài)學染色法低于TUNEL 法, 但二者差異不顯著(P>0.05)。

　　研究表明，精液CT感染導致了精子凋亡率增加，CT感染可能是導致男性不育的重要原因之一。

　　參考來源：《貴陽醫(yī)學院學報》2009年6月34卷3期；《沙眼衣原體感染與精子凋亡關系的初探》；楊丹，鄭立宏，高曉勤，石家齊

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