精子DNA碎片化在男性不育中的研究進展

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目前對精子DNA碎片的研究正處于初步探索的階段，且其具體發生機制尚未完全弄清。但現有的一系列研究結果顯示，其在輔助生殖技術領域中仍顯示出了巨大的預測價值。本文分析了精子DNA碎片發生機制、檢測技術有關問題的研究現狀，以及精子DNA碎片率增加對輔助生殖結局的影響。

1 精子DNA碎片種類和形式

從種類來源而講，精子DNA碎片包括核DNA碎片和線粒體DNA碎片。有相關研究表明不育男性的精子細胞核內存在較高水平的DNA碎片率，且與臨床妊娠率、分娩率呈負相關，并且Venkatesh等研究顯示，不育男性患者精子細胞質內存在高發的線粒體DNA損傷；而從DNA碎片形式來講，精子DNA碎片包括DNA單鏈碎片和DNA雙鏈碎片。迄今為止，研究人員已經認識到的DNA鏈損傷形式包括，全基質模式、堿基缺失(形成無堿基位點)、堿基修飾(堿基氧化、烷基化等)、DNA交聯等。一般情況下，DNA單鏈碎片較雙鏈碎片更為常見，且在一定條件下，如果單鏈DNA碎片不能及時被修復，某些DNA單鏈碎片會進一步破壞形成DNA雙鏈碎片，進而會造成DNA斷鏈之間和DNA一蛋白質的相互纏繞而形成較大的“DNA 碎片”，這既反映出了DNA碎片的產生是一個動態、循序漸進的過程，也標志著精子DNA損傷的嚴重程度存在著差異性，其對男性生育能力造成的影響也有所不同。

2 精子DNA碎片化的發生機制

2.1 精子細胞核結構特點

作為男性的配子生殖細胞，精子是一種單倍體，故其DNA含量僅是體細胞的一半。在正常狀態下，精子細胞除了合成少量功能蛋白外，基本上處于休止狀態。與體細胞的核蛋白(主要是組蛋白)不同，精子的核蛋白主要為魚精蛋白，后者是一種富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白。由于精子核DNA帶有負電荷，能夠與帶正電荷的精氨酸基團之間形成特殊的氫鍵；另外，半胱氨酸之間可形成分子間二硫鍵而有利于染色質絲的排列穩定。由于以上原因，使得精子核染色質的密度要明顯高于體細胞，精子頭部體積“適當縮小”，生化性質也比較穩定，以致能夠滿足精子穿透卵細胞的能力。然而，也正是以上因素，導致精子細胞核DNA 自身修復能力以及應對內外界環境有害刺激的能力大大降低。另一方面，從生精細胞分化、產生出功能正常的精子是一個很漫長的過程，且受到多種因素的協調控制，如果機體暴露于某些有害因素環境中，也就更容易造成精子發生過程中的遺傳物質損傷和結構功能異常。

2.2 精子DNA碎片化的發生機制

精子DNA碎片化發生的機制尚不完全清楚，但目前研究表明，主要與精子發生過程中遭受有害刺激因素后而弓l發的氧化應激有關，另外，還與精子發生過程中異常的染色體組裝、精子的異常凋亡有關。

2.2.1 氧化應激：氧化應激(OS)是指發生在需氧機體內的一種病理性效應。正常情況下，氧氣通過參與機體細胞內一系列“生物轉化作用”而形成各種各樣的氧化產物(某些具有較強的氧化性)，同時，機體細胞內存在具有一定抗氧化能力物質組成的抗氧化系統，在大多數生理環境條件下，機體內的氧化系統和抗氧化系統之間能夠保持相對平衡狀態。這種平衡不僅是機體內環境處于“穩態”的前提，而且是機體細胞能夠完成特殊生理、生化反應過程的一個重要保障。所以說，一切需氧細胞的生理過程中必然涉及到活性氧類物質(ROS)的產生和清除，但在某些情況下，生物機體受到環境有害刺激因素或其他條件的限制時，就會引起高活性氧化物質系統和抗氧化系統之間的平衡遭到破壞，機體也就進入氧化脅迫狀態(又稱氧化應激)，過量的活性氧類物質可造成細胞膜中多聚不飽和脂肪酸的氧化、細胞器生化反應涉及的關鍵酶受抑制和破壞、甚至細胞核DNA鏈的斷裂破壞等，從而導致機體的組織損傷和功能失調，甚至將存在缺陷的遺傳物質傳遞給后代而導致不良的妊娠結局。

研究報告表明，氧化應激與人體許多疾病狀態有關，包括衰老、動脈粥樣硬化、癌癥、肝臟疾病、風濕性關節炎、艾滋病、毒素、農藥化學制品暴露以及男性不育等。據此可知，一部分男性不育癥可能是伴隨著身體其他疾病而出現的。由于機體內不同組織和細胞的組成成分、結構特性等存在較大差異，因此它們對氧化應激的敏感性和反應性也就各不相同。1979年Jones等首先提出，人類精子對氧化應激特別敏感，并推測其可能與男性不育相關，即精子暴露于過量的活性氧分子環境中，可造成其細胞質膜中多聚不飽和脂肪酸的過氧化，引起多聚脂肪酸中雙鍵的破壞，而這些雙鍵對于維持精子膜的流動性又是必不可少的，因此，氧化應激可導致精子細胞膜結構受損，并且還能夠引起兩種嚴重的“連鎖反應”：一方面，氧化應激引起精子細胞膜結構受損，精子細胞的代謝功能受到抑制、甚至喪失，就可促進精子細胞的凋亡過程，引起精子細胞核碎裂，核DNA碎片增多等；另一方面，精子細胞膜的結構破壞，就會導致精子核DNA直接暴露于精漿中活性氧類物質中(主要是精漿中白細胞產生ROS)，這時就會導致精子DNA遭受ROS的正面攻擊而引起大范圍的DNA單鏈、雙鏈的斷裂、破壞，引起精子遺傳物質結構受損、功能缺陷而導致男性不育。在隨后的實驗研究中，將精子暴露于人工產生的ROS環境中培養一段時間后，可導致精子DNA多種形式的損傷破壞：包括堿基修飾、移碼、缺失、產生無堿基位點、DNA鏈斷裂、交聯以及染色體的重排等。Smith等研究顯示，與正常生育力男性相比較，精索靜脈曲張不育患者的精子DNA碎片指數要明顯高于前者，而且DNA碎片率指數與精液中ROS水平呈正相關。并且，在對上述患者施以精索靜脈曲張結扎術后，精子DNA碎片率指數顯著下降。由此研究人員推斷，精子DNA損傷以及碎片的產生可能與精液中較高水平的ROS相關。但就其具體的發生機制，仍尚未完全弄清。

2.2.2 精子發生過程中的染色質組裝異常：精子作為男性的配子生殖細胞，其染色體和DNA數量僅為體細胞的一半，而這是精原細胞進行染色質組裝、平均分配到2個精子細胞的結果。然而，精子核染色質的組裝過程容易受到機體內外環境的有害因素干擾而出現異常，進而導致精子遺傳物質方面的缺陷。正如早期研究所指出，隨著精子發生進程的開始，精子細胞核DNA就會發生一系列復雜的結構和生化功能方面的變化，尤其在精子發生周期中期時，伴隨著核組蛋白被魚精蛋白替代之后，精子核凝集程度大大增加，進而形成精子DNA超螺旋結構，然而在DNA超螺旋無限制的折疊壓縮過程中，就不可避免地引起DNA雙鏈之間存在扭曲應力。正因如此，為了能夠減少精子DNA雙鏈間扭曲應力的不利影響，以便促進魚精蛋白與DNA鏈的黏合附著，DNA鏈需要在其特定位點進行“解鏈”以及后來的酶修復連接使之恢復正常結構。但這一過程十分精細復雜，易被來自內外環境的各種有害因素所干擾，甚至引起精子DNA單鏈不能正常修復(超過其修復能力)，進而導致精子DNA雙鏈碎片的產生和染色質結構的破壞，而且，這一現象已在動物研究中證實。從這里可以看出，雖然精子為使其保持較強穿透卵子透明帶的能力，染色質最終能夠達到一個高度濃縮、凝集的特殊結構形式而有利于執行其功能，但從另一方面，同時降低了其本身應對內外環境損傷的修復能力。

2.2.3 精子異常凋亡：細胞凋亡，又稱為程序性細胞死亡，是真核生物有核細胞的一種主動性生理性過程，它是細胞在一定的生理、病理條件下而發生的以細胞核碎裂為主要表現的細胞死亡。早期研究人員即已發現，凋亡的細胞核內的DNA能被內源性核酸內切酶分解為一些分子量較小的雙股寡核苷酸片段。而后來，研究人員在其建立的動物實驗模型中，人工敲除小鼠的端粒酶催化亞基基因以誘導其進入細胞凋亡應激狀態，發現其精子DNA碎片率程度是其實驗前的7倍。因此，研究人員推測，小鼠精子DNA碎片率顯著增加可能與其凋亡應激狀態有關。

另外，氧化應激與人體的許多疾病狀態有關，而且能夠引起精子DNA的損傷、破壞、碎片率增高等。長期暴露于污染的空氣、吸煙、吸毒等都會導致精子DNA的碎片化程度增加。同時，高熱、工作環境溫度過高、睪丸局部血液循環受阻也是導致其精子DNA碎片率增高的有害因素。

3 檢測精子DNA碎片率的主要實驗方法

3.1 末端轉移酶介導的dUTP末端標記法(TUNEL)：該方法于1993年由Gorczyka等首先提出，它是一種直接檢測精子DNA損傷的方法。其原理是：精子DNA斷裂是以其脫氧核苷酸鏈中的3'',5''-磷酸二酯鍵打開而產生5''-磷酸基團和3''-羥基為特征的一種損傷形式，并且在適當條件下具有一定的修復能力(斷鏈的兩端可重新連接)，因此可利用末端轉移酶將一段預先標記好的核苷酸連接到斷裂DNA片段的3''-羥基端，然后在光鏡下或熒光顯微鏡下觀察精子DNA斷裂的情況。與其他方法相比，該方法不需要經過對DNA的變性過程，簡單便捷，而且能同時檢測單鏈DNA和雙鏈DNA的斷裂情況，因此能夠真實地反映出精子DNA的損傷程度。所以說TUNEL法是一種值得男科實驗室推廣應用的方法。

3.2 單細胞凝膠電泳(SCGE)：又稱為彗星實驗，它是一種在單細胞水平上檢測真核生物細胞DNA損傷的方法。該方法由Ostling和Johanson在1984年首先提出，其后經過研究人員的不斷改進，逐漸成為一種快速、靈敏、簡便的檢測精子DNA損傷的方法，其原理為：當精子DNA 損傷時會出現不同大小的DNA 片段，經過去污劑和裂解液處理后，精子細胞核內的DNA碎片、大部分蛋白質以及其他細胞成分就會滲出細胞膜進入裂解液，然后損傷的DNA片段在電場力的作用下就會向陽極遷移，從而形成特征性的“彗星”樣拖尾，用熒光染料染色后在熒光顯微鏡下進行觀察，從而根據彗星的頭尾長度和熒光強度來評估精子細胞DNA的損傷程度。后來，隨著人們對精子DNA研究的不斷深入，相繼有研究報告指出，前者實驗條件中的中性裂解液及其溫度條件不能使斷裂的精子DNA與其精核蛋白完全分開，而只能使小部分較小片段的雙鏈DNA解離、并在電場力的作用下移出細胞核形成“彗星”樣拖尾。隨后經過研究人員的不斷改進 ，即將電泳的條件由中性改為弱堿性，能更好地裂解精子細胞內的核酸、蛋白質等大分子物質，進而能夠在電場力作用下充分地移出精子膜形成較真實的的彗星圖像，反映精子DNA 斷裂的實際水平。最近，Ribas-Maynou等采用堿性-中性雙重彗星實驗，不僅使檢測結果的準確性顯著提高，而且能夠區分精子單鏈DNA碎片和雙鏈DNA碎片。

3.3 精子染色質擴散實驗(SCD)：SCD 法首先由Ferndndez等在2003年提出。它的原理為，精子細胞經過酸變性、去掉核蛋白后，其DNA就會從染色體上解離擴散，如果精子核的DNA沒有損傷(不形成DNA碎片)，就會擴散形成特征性的光暈。相反，如果精子核內DNA受損生成碎片時，就不會產生這種特征性的光暈，因此可根據光暈的有無和大小判斷精子DNA的碎片率水平。后來在2005年，Ferndndez等將其方法改進，形成一種Halosperm試劑盒，使用光學顯微鏡即可對結果進行觀察，同時能夠保持精子尾部的完整，從而有利于人們區分精子和圓形細胞等非精子成分。因此，與其他檢測方法相比，SCD法檢測結果的組內差異、組間差異相對較低，并且操作簡便、費用低廉，現在正被國內外越來越多的實驗室人員所認可和使用。

3.4 精子染色質結構分析(SCSA )：SCSA法已被當前世界范圍內大多數男科實驗室所認可采用，并用來評估男性生育力情況及預測體外受精和妊娠結局的關系。它的原理為：受損的精子DNA經過酸性溶液作用后容易變成單鏈，吖啶橙(AO)與雙鏈DNA結合可發出綠色熒光，而與單鏈DNA結合發出紅或黃色熒光，然后可通過流式細胞儀進行結果分析。SCSA法現被稱為檢測精子DNA碎片率的金標準方法。

然而，有研究人員指出，即使人們能夠檢測出精子細胞核內存在DNA碎片，那又能如何? 因為目前臨床醫務人員還不能“尋找”出一種特別有效的能夠預防精子DNA碎片產生、以及精子DNA碎片產生后如何治療等一系列針對性措施。因此也有研究人員提出，沒有必要浪費人力、財力去檢測精子DNA是否存在碎片，因為即使我們確定了精子DNA有損傷，也只能是“束手無策”。而Schlegel持有不同觀點，因為如果男性患者精子存在亞臨床損傷，含有較高的DNA碎片化指數，對醫務人員來說，這些患者的不育原因也就找到了，而不是所謂的不明原因性不育。對于以上患者，即使臨床醫生不能提供特別有效的治療方法，但是他們可以給患者一些相應的對癥治療，例如，藥物抗氧化劑、必需微量元素補充治療，指導患者避免有害環境、毒物暴露，改正不良生活習慣(吸煙、喝酒、工作壓力、睡眠質量差等)等有益的輔助治療措施。而這些對癥治療措施就足夠能讓一些患者從不明原因性不育的陰影中走出來而獲得成功的妊娠結局。因此，對精子DNA碎片進行研究應該有其重要意義。而精子DNA碎片率大小與男性生育力究竟存在何種關系，有賴于對其進一步的探討和研究。

(張帥，張云山，精子DNA碎片化在男性不育中的研究進展[J]山西醫藥雜志2012年10月第41卷第10期上半月：1005-1007)

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