Y染色體微缺失與男性不育

　　據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),育齡夫婦中約有10 %～15 %不孕不育,其中男性少精、弱精、無精子等不育因素約占40 %～50 %[1]。引起男性不育的原因很多，如遺傳因素、內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素，但尚有一部分無精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者原因還不明確，多表現(xiàn)為生精障礙，國(guó)內(nèi)外研究表明，其與Y染色體微缺失有關(guān)，男性原發(fā)性無精和少精癥患者中大約有7.5 %～15 %存在Y染色體AZF(azoospermia factor)區(qū)微缺失[2]。分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，中國(guó)人原發(fā)性無精與嚴(yán)重少精癥患者群體AZF區(qū)STS(sequence-tagged sites)微缺失率均高于17 %[3]。它是由于精子發(fā)生障礙而導(dǎo)致男性不育的最普遍的一種遺傳因素[4]。本文對(duì)Y染色體微缺失相關(guān)基因、主要原因、主要檢測(cè)方法聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain renction, PCR)及臨床意義進(jìn)行綜述。

　　一、Y染色體微缺失

　　Y染色體是一條小的近端著絲粒染色體，約有6.0×107個(gè)堿基對(duì)。Y染色體不是人類生命所必需的，它大部分區(qū)域是隱性功能區(qū)，其中性別決定區(qū)(由SRY基因控制)被認(rèn)為是Y染色體的主要區(qū)域。但隨著在Y染色體上發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生控制區(qū)，這個(gè)觀點(diǎn)發(fā)生了改變[5]。

　　1.Y染色體微缺失主要候選區(qū)域—AZF區(qū)：1976 年Tiepolo 等[6]首次報(bào)道6例無精子癥患者有Y染色體長(zhǎng)臂6 區(qū)(Yq6) 的缺失,包括遠(yuǎn)端熒光區(qū)和與其相連的非熒光區(qū),因此推測(cè)在Yq11上存在“Y染色體精子生成基因”，并由此揭開了研究Y染色體微缺失與男性不育關(guān)系的序幕。研究發(fā)現(xiàn)Y染色體長(zhǎng)臂的5～6 區(qū)間有一個(gè)AZF位點(diǎn),被分成3個(gè)與生育相關(guān)的功能區(qū)，AZF a區(qū)、AZF b區(qū)和AZF c區(qū),由于這些區(qū)域包括一些影響男胚細(xì)胞發(fā)育和維持的基因和基因家族,故其可影響精子發(fā)生。最近Kent等[7]在AZF b區(qū)與AZF c區(qū)之間還發(fā)現(xiàn)了第4個(gè)AZF區(qū)-AZF d 區(qū)。有資料顯示，在無精子癥和嚴(yán)重少精子癥的患者中,AZF 缺失約占3 %～29 % ,它是染色體異常導(dǎo)致無精子以外的第2個(gè)重要因素[8]。

　　AZF存在于Y染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端(Yq11.23)，其微缺失可以導(dǎo)致精子發(fā)生阻滯。睪丸活組織檢查發(fā)現(xiàn)，微缺失發(fā)生于同一亞區(qū)時(shí)，精子發(fā)生阻滯在同一時(shí)相，反之，則阻滯在不同時(shí)相。一般認(rèn)為AZF a區(qū)缺失的患者精子發(fā)生阻滯在青春期前階段, 表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征(SCOS)和小睪丸;AZF b區(qū)缺失表現(xiàn)為生殖細(xì)胞成熟障礙,即睪丸內(nèi)只見精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞,而精液中無精子;AZF c區(qū)缺失情況比較復(fù)雜，對(duì)于同一患者，一些生精小管內(nèi)僅見支持細(xì)胞，而另一些生精小管內(nèi)可見精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞甚至精子, 精液檢查為嚴(yán)重少精，有時(shí)可見少量活動(dòng)精子，但畸形精子數(shù)量明顯增多;中等程度少精或精子數(shù)目正常但形態(tài)異常提示有AFZ d區(qū)微缺失[9]。

　　2.Y染色體微缺失的其他基因：精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生理過程。生殖細(xì)胞從精原干細(xì)胞到精細(xì)胞進(jìn)行有秩序的增殖、分化而產(chǎn)生精子, 受到大量基因調(diào)控。因此，除AZF 區(qū)外,Y 染色體長(zhǎng)臂的SMCY 基因、短臂上的SRY、ZFY和TSPY基因也都與精子發(fā)生有關(guān)[8]。如果上述基因發(fā)生缺失或表達(dá)異常同樣會(huì)造成精子發(fā)生障礙或性腺發(fā)育障礙, 故這些基因在臨床上也有重要的意義。

　　3.Y染色體微缺失主要原因：(1)再發(fā)現(xiàn)象。即de novo 缺失(在患者男性直系親屬外周血分析中未見缺失)。這一缺失可能發(fā)生在其父親精子發(fā)生過程中或在其早期胚胎發(fā)育過程中。(2)垂直遺傳。主要發(fā)生在DNA 復(fù)制期，睪丸生殖細(xì)胞系缺失可產(chǎn)生有缺失的精子，如果這些精子使卵子受孕，將會(huì)產(chǎn)生Y染色體微缺失的個(gè)體,男性后代則繼承其父親生殖細(xì)胞中有缺失的染色體。(3)睪丸生殖細(xì)胞系中存在缺失的嵌合體。如父親外周血淋巴細(xì)胞中未見缺失,而通過ICSI(intracytoplasmic sperm injection)的男性后代卻有Y染色體微缺失,則說明嵌合體的存在[10]。

　　二、Y染色體微缺失的主要檢測(cè)方法

　　由于Y染色體微缺失可以導(dǎo)致男性不育，故其微缺失的檢測(cè)對(duì)患者的病因診斷和臨床治療及遺傳咨詢都是必要的[4]。但僅以臨床查體和精液分析為基礎(chǔ)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)不能確定Y染色體是否發(fā)生微缺失[11]，而PCR可以使少量的單拷貝基因在體外大量擴(kuò)增后直接觀察，且縮短了檢測(cè)時(shí)間。因此，一般應(yīng)用PCR方法檢測(cè)。1986年，Vergnaud建立了Y染色體基因微缺失圖譜[12]，為Y染色體基因分析創(chuàng)造了條件。接著，其他學(xué)者又列出了Y染色體上各DNA片段的PCR引物序列，為Y染色體精子發(fā)生基因的PCR檢測(cè)帶來了極大的方便。

　　1.常用的待擴(kuò)增目的基因及位點(diǎn)：Y 染色體是男性特有的, 其上存在有精子發(fā)生相關(guān)基因。一些精子發(fā)生的候選基因在AZF區(qū)被發(fā)現(xiàn)，有些候選基因甚至被認(rèn)為是精子發(fā)生的功能基因[4]，因此一般選擇對(duì)AZF區(qū)基因進(jìn)行擴(kuò)增。現(xiàn)在比較公認(rèn)的AZF區(qū)的候選基因是AZF c區(qū)的DAZ(deleted in azoospermia)和AZF b區(qū)的RBM(RNA binding motif)，但在PCR反應(yīng)時(shí)，也可根據(jù)情況對(duì)其它兩個(gè)區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。

　　AZF c區(qū)的最佳候選區(qū)為DAZ。1995年有人發(fā)現(xiàn)DAZ，并證明DAZ是人和猩猩所特有的，其專一地在睪丸內(nèi)表達(dá)[13]。研究表明，DAZ的表達(dá)蛋白可與RNA或單鏈DNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)RNA或DNA的功能。目前已發(fā)現(xiàn)果蠅和小鼠體內(nèi)也具有DAZ的同源基因，分別被命名為Boul基因和Dazh基因，這對(duì)為深入研究人類DAZ基因的特性和功能意義創(chuàng)造了條件。

　　AZF b區(qū)的最佳候選區(qū)為RBM，又名YRRM(Y chromosome RNA recognition motif)。1992年我國(guó)留英學(xué)者馬昆(Ma Kun)[14]用特異性探針在50例核型正常的無精子或嚴(yán)重少精子患者中發(fā)現(xiàn)4例出現(xiàn)Yq11.23區(qū)域的基因微缺失，認(rèn)為這4人的無精子可能由這些基因微缺失造成的。隨后，研究發(fā)現(xiàn)了MK5和MK29，均為1.9 kb左右，并證明了MK5高度專一地在人類睪丸內(nèi)表達(dá)。應(yīng)用基因文庫進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MK5和MK29均有編碼含RNA識(shí)別位點(diǎn)蛋白質(zhì)的序列，因此將MK5和MK29分別命名為YRRM1和YRRM2，提示在Y精子發(fā)生初期，該基因可能參與RNA的形成、加工和翻譯等過程。

　　根據(jù)Vogt等[9]對(duì)AZF區(qū)定位結(jié)果顯示AZF a區(qū)、AZF b區(qū)、AZF c區(qū)的長(zhǎng)度分別約為782 kb、3. 2 Mb及3. 5 Mb，且有資料顯示AZF a區(qū)缺失占全部AZF缺失的4.9 %[15]。在試驗(yàn)及臨床檢測(cè)中一般進(jìn)行擴(kuò)增的位點(diǎn)是SY84，SY86(AZF a區(qū))、SY127，SY134(AZF b區(qū)的RBM基因)、SY254，SY255(AZF c區(qū)的DAZ基因)，由于AZF d區(qū)較其他三個(gè)區(qū)發(fā)現(xiàn)的晚，一般在檢測(cè)中不進(jìn)行，如果進(jìn)行，SY152是選擇位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，SY152位與DAZ基因的近側(cè)區(qū)，單一SY152缺失可以導(dǎo)致精子發(fā)生成熟期的阻滯，在睪丸活檢中不能發(fā)現(xiàn)精子[16]。在檢測(cè)中也可以根據(jù)實(shí)際情況選擇相應(yīng)的其它位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，如SY82(AZF a區(qū)),SY143、SY133、SY128、SY129(AZF b區(qū)),SY154、SY242、SY239(AZF c區(qū)),SY145(AZF d區(qū))。

　　目前Y染色體微缺失檢測(cè)絕大多數(shù)是提取患者外周血，進(jìn)而分離出淋巴細(xì)胞作為樣本,亦有研究者取精液或單個(gè)精子,極少研究者同時(shí)取精液和外周血。因?yàn)橥庵苎獧z測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)便、取材容易,且一般認(rèn)為外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA與胚細(xì)胞如精子基因組DNA相同[17-20]。但無論采用什么方法，患者在檢測(cè)前都要進(jìn)行詳細(xì)的檢查，包括臨床檢查、生育力及家族史，以便排除其他無精癥的原因[11]。

　　在進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)時(shí)，即可進(jìn)行單重PCR也可進(jìn)行多重PCR。單重PCR時(shí)一般選擇對(duì)AZF b區(qū)或AZF c區(qū)進(jìn)行特定位點(diǎn)擴(kuò)增，而多重PCR時(shí)一般對(duì)四個(gè)區(qū)全部進(jìn)行擴(kuò)增，大約10～18個(gè)位點(diǎn)，且AZF c區(qū)的DAZ及AZF b區(qū)的RBM所占比重較大。在多重PCR時(shí)，也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行分組擴(kuò)增。

　　2. PCR檢測(cè)主要注意事項(xiàng)：Y染色體PCR檢測(cè)與一般PCR過程相似，都經(jīng)歷了高溫變性、低溫退火、適溫延伸，但有的學(xué)者認(rèn)為在反應(yīng)體系中除了正常內(nèi)參照、陽性參照、陰性參照之外還應(yīng)用水來做空白對(duì)照，以排除假陽性或假陰性的可能[11]。也有資料顯示，雖然水樣反應(yīng)體系包含了所有的反應(yīng)必須底物，卻易于被污染[21]。

　　由于檢測(cè)中不可避免出現(xiàn)誤差，故在結(jié)果觀察時(shí)，應(yīng)保證連續(xù)3次以上PCR反應(yīng)都沒有相應(yīng)條帶出現(xiàn)，才說明其相應(yīng)基因發(fā)生微缺失[11]。

　　在研究的資料中，Y染色體微缺失發(fā)生頻率有較大差異，造成這種差異的原因有多種。可能是由于，(1)病例選擇。對(duì)于病例選擇嚴(yán)格，即僅對(duì)不明原因的無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者進(jìn)行檢測(cè)，缺失率較高。(2)實(shí)驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件的好壞，直接影響到結(jié)果的可靠性。(3)檢測(cè)區(qū)域。檢測(cè)不同區(qū)域也會(huì)得出不同的缺失率;(4)人種差異[12]。

　　三、Y染色體微缺失檢測(cè)的臨床意義

　　1.確定部分無精子癥患者病因：在男性不育的患者中尚有約11 %病因不明,稱為特發(fā)性不育(idiopathic infertility) ,其中最常見的表現(xiàn)是無精子和嚴(yán)重少精子[4]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為其與Y染色體微缺失有關(guān)。

　　2. 減少病人痛苦及提高輔助生殖幾率：對(duì)于無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失的檢測(cè)是很必要的。如果患者是AZF c區(qū)或部分AZF b區(qū)缺失，則有50%的幾率可以檢測(cè)出精子，但如果是整個(gè)AZF b區(qū)缺失，則檢測(cè)出成熟精子的可能性幾乎為零[22]。有報(bào)道表明如果患者發(fā)生缺失的部位是在AZFa 區(qū),則沒有精子形成的可能[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，AZF c區(qū)缺失的患者54%表現(xiàn)為無精癥，46%表現(xiàn)為嚴(yán)重少精癥[23];AZF a、AZF b、AZF c區(qū)同時(shí)缺失，則一定為無精癥;AZF a區(qū)完全缺失或AZF b和AZF c兩區(qū)同時(shí)缺失，96%表現(xiàn)為無精癥，4%表現(xiàn)為嚴(yán)重少精癥。因此，對(duì)于沒有可能形成精子的患者就不需要進(jìn)行輔助生殖，可使患者身體和精神傷害降低，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)減少。但對(duì)于有精子形成可能的患者，就可以嘗試通過(testicular sperm extraction，TESE)進(jìn)行ICSI或者(in-vitro fertilization，IVF)。

　　雖然AZF c區(qū)缺失患者有可能形成精子，但隨著時(shí)間的推移，患者的精子量會(huì)逐漸減少，那么如果在早些時(shí)候凍存患者精液，在其想生育時(shí)就可以避免睪丸穿刺的痛苦，而且精液質(zhì)量也較高[22]。

　　還有資料顯示，對(duì)于無精子癥患者進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)可以避免睪丸基因表達(dá)分析，而直接找到睪丸組織中成熟精子[4]。

　　3.提供遺傳咨詢：隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，異常基因的垂直傳播越來越被人們所接受，故那些要選擇輔助生殖夫妻的男性后代將遺傳其父親有微缺失的異常性染色體，甚至?xí)�產(chǎn)生更多的微缺失而導(dǎo)致更嚴(yán)重的睪丸表型[11]。因此，很多學(xué)者建議應(yīng)向這些患者及其配偶提供遺傳咨詢服務(wù)，使他們知道后果并做出選擇，是否進(jìn)行輔助生殖;是否在進(jìn)行植入前直接選擇女嬰[24]。

　　總之，Y染色體微缺失的檢測(cè)非常必要，它不僅可以被定義為無精子癥的原因，還可以對(duì)那些無精子癥及嚴(yán)重少精子癥的患者及其男性后代提供大量的最適合臨床治療的寶貴信息[22]。

　　四、發(fā)展前景與新的挑戰(zhàn)

　　最近有學(xué)者提出，從患者口腔粘膜中提取DNA快速有效[25]，這樣不僅可以縮短檢測(cè)時(shí)間，也可以降低患者痛苦，使其損傷減少。

　　現(xiàn)在對(duì)于Y染色體AZF四個(gè)區(qū)的微缺失所表現(xiàn)的疾病類型有所了解，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)相應(yīng)疾病表現(xiàn)類型進(jìn)行相應(yīng)區(qū)段、甚至相應(yīng)位點(diǎn)的擴(kuò)增，這樣即降低了患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，又可以對(duì)病因做到基因水平上的準(zhǔn)確定位。

　　現(xiàn)在患者目的基因一般都來自于外周血淋巴細(xì)胞。如果外周血基因組DNA與胚細(xì)胞如精子的基因組DNA表達(dá)一致,則外周血可以代替胚細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，但是如果二者表達(dá)不一致,那就說明單純檢測(cè)外周血是不可信的,進(jìn)行ICSI 治療的患者有必要進(jìn)行胚細(xì)胞DNA 的Y染色體微缺失檢測(cè),以明確是否攜帶有Y染色體微缺失[25]。這就需要尋求一種新的、快速、方便、有效的方法來進(jìn)行檢測(cè)。

　　對(duì)于Y染色體微缺失的檢測(cè)，不僅對(duì)臨床診斷方法的發(fā)展起到推動(dòng)作用，還幫助人們?cè)鲩L(zhǎng)對(duì)于精子發(fā)生的知識(shí)，也許存在其它可以導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的基因因子或未知精子發(fā)生基因[4]，故現(xiàn)在還不能從真正意義上了解和掌握與精子發(fā)生相關(guān)基因的生化功能，不能明白Y染色體微缺失的基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系。

　　隨著科學(xué)的發(fā)展，技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)Y染色體微缺會(huì)有更深入的了解，相信以上這些問題都會(huì)得以解決。

　　參考來源：《中國(guó)生育健康雜志》2007年4月18卷3期；《Y染色體微缺失與男性不育》；韓瀟 綜述 劉睿智

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