男性不育精液檢查

　　近20年來，男科學的研究有了長足的進步，男科也作為一個學科從泌尿外科中獨立出來。在男科學中，男性不育是一個重要內容，而精液檢查是診斷男性不育的重要手段，隨著研究的深入及細胞分子生物學技術、計算機技術等的迅速發展，原有的檢查方法不斷得到改良，新的診斷技術和設備也是層出不窮，一些檢查指標的相關機理有了合理的解釋，使得我們對男性不育機制的認識更加深刻、全面，對不育原因的分析更加準確、可靠。為了對男性不育的精液檢查有進一步了解，現將近年來原有檢查方法的一些改進以及新出現的檢查手段作一個大概的介紹。

　　1 常規精液檢查的主要指標及研究進展

　　精液常規檢查是最為簡便實用的方法，可了解由精液因素所致的不育，對指導下一步的檢查和治療提供重要依據，避免了女方過多的、不必要的檢查。近年來精液檢查各項主要指標的研究均有一定進步，特別是計算機輔助精液分析系統及新的檢查方法進入臨床檢驗使精液分析更加快速、簡便、準確、直觀，更加具有臨床價值。

　　根據世界衛生組織（World Health Orgnization，WHO）《精液及精子一宮頸黏液相互作用實驗檢查手冊》(第3版)［1］精液常規分析主要指標有。

　　1.1 精液量

　　檢測精液量的方法有刻度量筒法和稱重法，因稱重與精液密度有關，故以刻度量筒法較為準確。

　　精液量的多少男性生育能力有一定關系。成年男子每次射出的精液量正常為2 ml～6 ml，與排精的間隔時間、營養狀況、個體差異、生殖器官功能有關。精液量隨年齡也有一定的變化規律［2］。如每次射出的精液量少于2 ml，即為精液過少，可以由于性交次數過頻、精液的產生和貯備不足引起，因此，精液檢查前應禁欲3 d～7 d。精液量過少引起不育或生育力低下的機制有： 精液量過少，不能充分中和陰道中的酸性分泌物，影響精子的生存與活力；精漿中的果糖等成分，可為精子活動提供能量，精液量過少，不能維持精子足夠的營養，影響精子的活力；精液量過少，性交后不能在陰道后穹窿形成足夠的精液池，不利于精子上行進入女方子宮頸管。

　　1.2 精子總數

　　精子總數是判斷男性生殖能力的主要指標，正常成年男子每次射精其精子總數為4億～6億。當每次射精其精子總數低于1億時定義為少精子癥。精液中沒有精子則稱為無精子癥。因精子數量過少而受孕機會降低。少精與無精主要有各種原因為造成的生精阻滯(精索靜脈曲張、泌尿生殖道感染、營養、內分泌等)、生殖道不完全性梗阻、遺傳因素等。其中有50％原因不明，為特發性無精、少精癥。精子計數同時也受一些因素影響，例如年齡大小［2］、使用手機的時間、吸煙、季節變化、農藥及殺蟲劑等等。

　　1.3 精子密度

　　精子密度檢查方法有血細胞計數板、Macro計數板（類似Mackle計數板）、Cell－VU計數板，WHO推薦血細胞計數板作為金標準，但是該法不能同時進行精子活力測試，且結果較真實值偏高。Macro計數板則是CASA的配套產品，可同時進行精子活力分析。最近引進國內的Cell－VU則測試數值最接近真實值，而另外兩種測試方法均明顯增高。Cell－VU可一次性或多次使用，在檢查傳染性強的標本時有獨特優勢。相對于保證測試結果的準確性和進行精液質量控制來說，Cell－VU計數板方法應該是最理想的。精子密度也與男性生殖能力相關，正常成年男子精子密度應>20×106/ml，若低于該值，即為精子密度過低，可能原因為精子總數正常而精液量過多稀釋或精液量正常而精子總數下降所致。精子密度同時受精液量和總精子計數的影響，任何影響這兩個指標的因素均可以影響精子密度的變化。

　　1.4 液化時間

　　正常精液標本在60 min內液化，且在15 min內完成，若超過60 min不能完全液化，則稱為精液液化異常。液化異常可影響精子的活動，降低精子活力，導致不育［1］。人類精液具有凝固并在短時間液化的特點。正常男性的精液剛射出時呈稠厚的膠凍狀，有利于精液在女性陰道中停留，隨后開始液化，有利于精子活動。這個過程由精液中的凝固和液化因子來調節，前者主要來源于精囊，后者主要來源于前列腺。當液化與凝固因子間的平衡被打破，精液可表現為液化異常。液化障礙多與精囊和前列腺炎癥、先天性畸形或性腺功能異常有關。

　　根據形態學及生化分析將精液液化分為三個階段：第一階段為肉眼下凝膠狀物質的溶解以及超微結構下球狀顆粒的消失；第二階段為溶解的蛋白質降解為肽；第三階段為肽降解為氨基酸。

　　參與精液凝固及液化的因素有:Semonogelin(Sg): 包括Semonogelin I(SgI)和Semonogelin Ⅱ(SgⅡ)，他們是男性精囊液和精液凝膠中的主要成分，由精囊腺上皮分泌，是20號染色體上不同基因的產物，主要功能是使精液射出后立即呈凝膠狀態，抑制精子運動, 可作用于完整精子的鞭毛，對精子的活率、速度具有可逆且濃度依賴的抑制作用［3］。；前列腺特異抗原(Prostate Specific Antigen，PSA)：由前列腺上皮細胞合成，為絲氨酸蛋白酶，編碼PSA的基因位于19號染色體長臂［4］，屬腺體分泌的激肽釋放酶基因家族。PSA是精漿中最豐富的蛋白酶，其生理功能為降解精液凝膠中主要蛋白(sgI、sgⅡ及纖維連結蛋白)，使精液在5 min～15 min內液化［4，5］；參與該過程的其他成分：纖溶系統的某些成分、其他蛋白酶類、金屬離子也參與到這個精液液化的過程。以上因素如果存在異常，均可影響精液的液化過程，影響精子活力，導致不育。

　　1.5 精液pH值

　　檢測精液pH值一般采用pH試紙法。正常情況下精液pH值處于7.2～8.0之間，是精子活動的最佳環境。pH值過高或過低均對生育能力有所影響，特別是當pH值偏酸時，精子的活力和代謝均下降。pH值為6.0時精子活動停止。偏堿性的精液可中和陰道酸性分泌物，保護精子正常活動，但當pH值>9.0時精子活動與代謝下降。當附屬性腺感染時，精液pH可>8.0，結合精漿彈性蛋白酶含量的檢測可提高診斷感染的準確度；當輸精管梗阻或精囊腺病變時，精液pH可下降。精液的pH值在不育男性患者能夠部分反映男性性腺及附屬性腺的發育和功能狀況，對分析病因很有意義。

　　1.6 精子正常形態率

　　目前使用的精子形態學分析有6種方法：改良巴氏染色法、蘇木精－伊紅染色法、瑞氏染色法、瑞－吉氏染色法、Diff－Quik染色法和Shorr染色法。基于不同染色法對精子頭部大小的影響、染色效果及操作簡易與否，Diff－Quik染色法和Shorr染色法值得推薦。

　　正常精液的精子正常形態率≥30％［1］。但正常精液也有異常形態的精子，當異常精子數量超過40％為畸形精子癥。

　　精子形態與精子活力的關系：很多外界因素，如激素［6］、細胞因子［7］、氧自由基［8］、某些基因［9］、殺蟲劑［10］、微量元素［11］、禁欲時間等，都會引起精子形態異常及精子活動力降低。這些因素同時作用于精子形態和精子活動力，所以兩者變化常相伴產生，而前者對后者的影響可能只是次要原因。精子形態異常時精子運動表現為，曲線性上升，直線性下降，動態參數表現為VCL、VAP、ALH、WOB升高，而MAD、LIN、STR降低，VSL也有下降趨勢，另外，頸部中段異常引起的精子機能和形態改變對精子運動特征影響較小。

　　1.7 精液白細胞計數

　　檢驗精液白細胞的方法有4種。直接鏡檢法：簡便易行，但有時與生精細胞難以區分；過氧化物酶染色法：受細胞成熟度及涂片技術等影響；熒光原位雜交法：可根據雜交信號的數目和位置，結合細胞核特有的形態對白細胞進行鑒定；免疫細胞化學法：根據白細胞表面標志，用抗白細胞及其亞群的單克隆抗體結合酶標記進行反應，此為目前檢測白細胞的最可靠的方法，但操作復雜，試劑昂貴，而且因其靈敏度高，陽性率也相應提高，故診斷標準亦應作相應修改。

　　正常精液白細胞計數<1.0×106/ml，白細胞增多，常見于感染、自身免疫性疾病、吸煙、酗酒等患者。當精液白細胞計數超過1.0×106/ml時診斷為白細胞精子癥［1］。在男性不育病因中約占10％～20％［12］。但精液白細胞增多并非導致不育的直接因素。而是伴隨著精液白細胞數的增多，白細胞產物（如干擾素、腫瘤壞死因子等）濃度升高，才表現出對精子的損傷作用，引起精液參數變化及精漿抗氧化能力下降。

　　精液白細胞在吞噬過程中產生活性氧(超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等)［13，14］，損傷精子膜、膜酶，損傷線粒體，使ATP生成減少，精子活力下降，同時引起精子染色質異常和DNA損傷，影響穿透卵子的能力；大量白細胞在附睪、前列腺上皮浸潤，引起附屬性腺功能障礙，精漿成分異常，液化與凝固因子比例失衡，影響精子在生殖道中的運行和成熟；IL��8、γ�睮NF和TNF��α使精子運動能力降低；TNF��α還可啟動細胞免疫，抗精子抗體產生增多，增強白細胞對精子的損傷［7］。

　　1.8 精子活動力

　　精子活力指精子前向運動的能力。精子應有良好的活動力才能通過女性生殖道到達與卵子結合的場所實現受精。為便于操作將精子活力分為a、b、c、d 4級［1］：a級：為快速前向運動，即37℃時向前運動速度≥25 um/s，或20℃時≥20 um/s。b級：為慢速或呆滯的前向運動，向前運動速度介于a級與c級之間。c級：為非前向運動，即37℃時向前運動速度<10 um/s。d級：為無運動精子，即37℃時向前運動速度為0 um/s。

　　通常說的精子活動率是指a、b、c三級活力百分率的總和。而臨床上只有前向運動的精子才有可能到達受精的位置。WHO將a級≥25％ 或a+b級≥50％作為正常精液精子活力的參考值，未達上述指標稱為弱精子癥。此外，精子活力與溫度相關，所以進行活力評估時，應使溫度恒定，一般維持在37℃。此外精子活力也受年齡、禁欲時間、生活習慣、季節、許多因素的影響。弱精子癥，是男性不育的首要病因［1］，其原發病因很復雜，精索靜脈曲張、泌尿系感染等均可引起。

　　精子活動力的檢測有手工分析及CASA系統分析兩種方法。但因為手工分析帶有較大的主觀性，對精子運動能力缺少量化標準，誤差大，且精子活動力受時間和溫度的影響較大，手工分析時這種影響會更大，不作為標準化的方法被推薦。

　　計算機輔助精液分析（Computer Assisted Semen Analysis，CASA）是利用錄象機或攝象機和計算機視屏技術產生的新技術，通過攝象機與顯微鏡連接，確定和跟蹤個體精子細胞的活動，并將所獲得的電子信號輸入計算機，通過分析，除了可以給出常規參數外，還可測定描述精子細微運動方式的動態參數。弱精子癥患者的動態參數會有一定程度的改變。

　　CASA測定的動態參數：平均路徑速度(VAP)：在CASA中就是以精子沿軌跡曲線行走的平均速度將精子運動速度將精子活力分級的。同樣分為a、b、c、d四級；曲線速度(VCL)：精子頭部實際行走的軌跡路徑速度；直線速度(VSL)：精子頭部呈直線移位的前向運動速度。鞭打頻率(BCF)：精子頭部跨離精子運動路徑的頻率。

　　精子運動方式參數：直線性(LIN)：表明精子實際的行走路線的曲折程度；前向性(STR)：表明精子平均移動軌跡的曲折程度；擺動性(WOB)：表明精子實際運動軌跡相對其平均路徑擺動的程度；側擺幅度(ALH)：表明實際運動軌跡相對平均移動軌跡的偏離程度。

　　CASA與人工方法比較的優點與缺點［15］。優點： 顯著地提高工作效率，降低人為誤差，動態指標的檢測更客觀、更精確；將計算技術與圖案處理技術進行了有機結合，動態地進行運動觀測，并能提供精子動力學的量化數據；檢測的速度快，捕捉的信息量大。缺點：受設備價格昂貴、實驗室條件等因素限制，較難普及；評估精子密度的精確度還受精液中細胞成分和非精子顆粒物質影響；c和d級精子不易區分；CASA系統設置缺乏統一的國際標準，不同廠商和型號的系統分析結果可比性差，尤其是精子密度和活動率。

　　近年來，CASA技術也不斷的得到改良，出現了DNA熒光染色CASA，為精確測定精子密度提供了可能［16］，雖然對精子形態學的自動分析尚未十分完美，但對比手工法仍更加準確。另外，也有人將CASA作為預測男性生育能力的工具［17］。

　　2 其他精液檢查方法

　　2.1 精漿生化檢查

　　精漿中的一些生化標志可反映男性生殖系統等，有利于綜合評價不育的發病原因和機制。由于相對簡單易于操作，某些項目已成為實驗室的常規檢查。

　　游離左旋肉毒堿、甘油磷酸膽堿和中性α�财咸擒彰缚煞从掣讲G功能。中性α�财咸擒彰甘歉讲G分泌功能的指標，較其他兩種檢測更特異、更靈敏。結合激素等其他指標，對遠端輸精管阻塞有較好的診斷價值，是診斷梗阻性無精子癥的理想方法。

　　精液果糖由精囊腺產生，可反映精囊腺功能。有苯二酚顯色法、氣象層析法、吲哚顯色法三種測定方法。其中苯二酚顯色法因操作簡單、特異性好最常應用。精囊腺功能紊亂時，精漿果糖含量降低，進而引起精子能量不足，活力下降。先天性無精囊或精囊發育不良所致無精癥者，果糖為0或微量。單純輸精管阻塞性無精癥者，果糖含量正常。果糖和中性α�财咸擒彰钙咸擒彰竷烧呦嘟Y合，可大大提高對梗阻性無精子癥的診斷。

　　檸檬酸、鋅、鎂、谷氨酰轉肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶檢測已成為男科實驗室的常規檢查，常用磷酸苯二鈉法。

　　男性生殖道感染時，分葉核粒細胞參與吞噬病原體等抗炎反應時分泌于精漿的彈性蛋白酶，作為靜止型生殖道感染的診斷及愈后檢測指標的可靠性，得到了WHO的認可。

　　也有學者［18］發現精子癥患者的精子懸液的肌酸激酶(CK)水平明顯高于正常生育男性；而嚴重少精子癥患者(精子密度<5×100/ml)CK水平顯著升高，以精索靜脈曲張的患者升高最明顯，提示精漿CK可作為精子質量和成熟的敏感指標，CK 升高的水平與異常功能精子增加率和胞漿潴留增加有關。

　　2.2 精漿細胞因子的檢測

　　精漿細胞因子由男性泌尿生殖道內的各種細胞分泌，包括轉化生長因子、表皮生長因子、腫瘤壞死因子、各種白細胞介素(IL)及某些可溶性受體等。目前認為，與男性不育有關的細胞因子主要有IL��6和IL��8，不育患者精漿中IL��6和IL��8水平明顯高于生育力正常的男性。測定IL��6和IL��8的方法有：生物學方法、分子生物學方法和免疫學方法，以免疫學方法多用，尤以ELISA和RIA常用。

　　2.3 精漿總抗氧化能力測定

　　總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)代表體內酶類和非酶類抗氧化物的總體水平，各抗氧化物質之間有著相互聯系，起協同保護作用。梗阻性、非梗阻性無精子癥患者、少精子癥患者、弱精子癥患者和少弱精子癥患者的精漿TAC水平明顯低于正常生育男性。其水平與精液活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)相關。ROS是一類具有比氧更為活躍化學反應性的氧代謝產物及其衍生物，主要包括O2- 、H2O2、OH-等。通過損傷精子細胞膜、線粒體、染色質，破壞精子結構，使精子運動相關的酶失活，引起精子數量、形態、運動、頂體反應異常。目前研究認為除了原發性的因素以外，影響精液TAC及ROS因素主要有：精液中的白細胞、精索靜脈曲張、慢性前列腺炎和過度吸煙(>20支/d)等，這些患者精漿TAC水平均有所下降［19］，精液中的白細胞能使ROS增高，TAC水平下降［13］。精索靜脈曲張患者精漿中TAC水平顯著降低［20］，慢性前列腺炎患者精漿中TAC水平顯著降低［21］，過度吸煙的不育男性精液中ROS增多，而TAC水平下降［22］。

　　2.4 精液頂體酶活性測定

　　精子頂體酶是存在于頂體內的一種蛋白水解酶，以酶原形式合成并儲存在頂體內，發生頂體反應時，頂體酶原釋放，為精卵結合提供條件。精子質量與精子頂體酶活性有很好的相關性［23］。精子頂體酶活性正常與異常的精液，其精子密度、活動率、活力等參數均有顯著差異。這三個指標越高，精子頂體酶活性越高。而在精子頂體酶活性降低的精液中，精子的活動率降低，a級精子明顯減少，而活力差的d級精子明顯增多。少、弱、死精子癥患者的頂體酶活性顯著降低。

　　2.5 雙向蛋白電泳［24］

　　國內有人利用雙向電泳方法對比分析了弱精癥患者及正常生育男性的精液，均出現了7條蛋白帶，但其中2種蛋白在弱精癥患者中高度表達，而另外5種恰恰相反。說明某些蛋白在弱精癥患者中特異性表達，具體情況有待進一步研究。

　　2.6 流式細胞學檢查［25］

　　能提供人工檢查相同的精子計數、精子活力、活動率、圓形細胞計數、抗精子抗體等指標，但是更加準確。

　　2.7 精子染色質結構測定（sperm chromatin structure assay，SCSA)［26］

　　可以作為常規精液分析的補充，發現一部分常規精液檢查無法檢查到的核型異常。

　　3 討論

　　精液質量控制是熱點問題，國內及國外均有報告表明，由于采用的檢驗方法、設備、標準和檢驗人員的水平等多種客觀或人為因素的影響，造成了各實驗室間檢驗結果存在很大的變異，即使是同一個實驗室同一份精液，檢查結果也可能存在明顯差異，實驗間難以進行比對，同時也對進行大范圍、多中心、不同實驗室進行統計分析造成一定困難，精液分析的可信度受到質疑。于是進行精液質量控制被提上日程，并付諸實踐。國外早在20年前就提出了精液質量控制的觀點，并且在某些地區已經取得了一定成果，國內近些年也越來越重視精液質量控制。經過一段時間的實踐，人們總結出以下幾點建議［27］： 所有實驗室應該采用普遍接受的檢測標準和指標；所有實驗室應該參加室間測評計劃；實驗室應該執行有效的室內質控和質量保證計劃，以保證報告結果準確和可重復；臨床醫生應該指定患者在嚴格執行上述建議的實驗室接受精液分析，或只認可這些實驗室提供的精液分析結果。實踐證明，精液質量控制對精液分析標準化是有效果的。然而最近，提倡精液質量控制的先驅者之一Anne Jecquier［28］從臨床醫生的角度提出了不再需要精液質量的觀點，認為只需要進行適當的精液檢查，而不必要仍然堅持耗費時間和金錢的精液質量控制。有人支持，當然也有人反對。總的來說，精液質量控制的成果是可以肯定的，有利于提高精液檢查的準確性，有利于進行實驗室間的比較，有利于進行大規模、多中心的研究，仍需要繼續實行、推廣，但由于各個實驗室的客觀條件不同，精液檢查應用的目的不同，不可能強求一律嚴格按照科學研究的標準執行。對于進行科學研究的實驗室，保證能夠得到準確的結果是最重要的，所以要嚴格按照標準執行。對于一些臨床診所，僅需要對精液情況進行分析，為生育能力評估提供參考，不必要過于拘泥，造成財力及時間的浪費，但仍然需要精液質量控制，以免過于寬松而影響精液檢查結果的可信度。

　　男性不育是最常見的人類生育失敗的原因之一，雖然對精子生理學和精子與配子相互作用的生物學過程的研究已取得很大進展，原有的檢查方法得到一定的改進，各種各樣的檢測方法也層出不窮，但這些方法在簡便性、經濟性、實用性、可靠性方面尚待進一步提高，各實驗室檢查質量控制的實施也存在差距，而且目前仍缺乏預言精子特征十分準確、與配子受精能力密切相關的診斷技術，仍需進一步改善檢查技術，尋找新的檢查方法，做好精液質量控制。

　　參考來源：《實用醫技雜志》2007年12月14卷36期；《男性不育精液檢查研究進展》；孫爍磊

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