環孢素A對早孕期人細胞滋養細胞增殖與凋亡的影響

　　環孢素A自20世紀70年代應用于臨床以來，作為免疫抑制劑發揮了極其重要的作用；環孢素A（新山地明）是目前公認的抑制移植排斥反應最為有效的藥物。環孢素A（新山地明）對某些自身免疫性疾病的治療亦已取得一定的療效。正常生理妊娠類似于同種異體移植，胚胎作為自然的同種移植物不受母體免疫排斥是免疫排斥現象的唯一例外，實際上反映母體對胚胎的免疫耐受。而妊娠失敗多因母體對胚胎的免疫排斥所致。

　　環孢素A（新山地明）研究通過原代培養早孕期人細胞滋養細胞及JAR滋養細胞株，在CsA作用下，研究作為自然移植物的細胞滋養細胞生物學功能及功能基因表達的改變及其信號轉導機制。為反復自然流產等妊娠疾患的治療提供線索。

環孢素A（新山地明）對早孕期人細胞滋養細胞增殖與凋亡的影響及其信號轉導機制

　　目的 探討環孢素A（新山地明）（Cyclosporin A，CsA）對早孕期人細胞滋養細胞及人滋養細胞腫瘤細胞系JAR增殖與凋亡的調控作用。

　　方法 應用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮（Percoll）密度梯度離心法，分離純化早孕期人細胞滋養細胞，經免疫細胞化學和流式細胞儀鑒定其純度；采用MTT法評價早孕期人細胞滋養細胞及人JAR細胞系活力；PCNA-PE單標志流式細胞術分析細胞增殖情況、Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術分析細胞早期凋亡；通過Western blot觀察pERK1/2的水平；ELISA分析MAP激酶活性。細胞內共轉染AP-1-Luciferase、NF-κB-Luciferase、NFAT-Luciferase與Renilla Luciferase-SV40報告質粒，采用熒光素酶報告基因雙檢測系統分析各轉錄因子的啟動子活性。

　　結果

　　（1）CsA在有效劑量范圍內（1×10^-4～1μmol/L）以濃度依賴方式增強早孕期人細胞滋養細胞活力和PCNA表達；以1.0μmol/L的CsA促進作用最強。CsA濃度達10.0μmol/L時，則抑制細胞滋養細胞的增殖活性；對JAR細胞系呈現類似作用。
　　（2）TGF-β1、TGF-β2抑制細胞滋養細胞基礎的及CsA誘導的增殖活力，TGF-β1中和性抗體可增強細胞滋養細胞自身或CsA誘導的增殖活力，TGF-β2中和性抗體可增強CsA誘導的細胞滋養細胞增殖活力，對滋養細胞自身的增殖活力沒有明顯影響。而無論TGF-β1、TGF-β2或其中和性抗體對于JAR細胞系的增殖活力均沒有影響。
　　（3）早孕期人細胞滋養細胞凋亡率較低，血清饑餓48h后，Annexin V-FITC、PI細胞明顯上升，約為20.34±4.18％（P<0.01），提示滋養細胞凋亡明顯增加。加用不同濃度CsA處理后，滋養細胞凋亡顯著減少，其抑制作用呈劑量依耐關系。當CsA濃度為1.0μmol/L時作用最強，此時細胞滋養細胞早期凋亡率下降至9.54±2.43％（P<0.01）。而CsA濃度達10.0μmol/L時，體外培養的細胞滋養細胞早期凋亡增加至25.7±1.08％。
　　（4）Western blot、ELISA顯示，CsA以時間和劑量依賴性方式促進細胞滋養細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。U0126預處理可抑制CsA誘導的細胞滋養細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。NFAT抑制劑對CsA誘導的細胞滋養細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化無顯著影響。 
　　（5）CsA以時間和濃度依賴性刺激JAR細胞AP1、NF-κB啟動子活性；抑制ionomycin+PMA誘導的JAR細胞NFAT啟動子活化。
　　（6）MEK激酶抑制劑U0126以劑量依賴方式抑制滋養細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化的同時，抑制AP1、NF-κB啟動子活性，抑制細胞滋養細胞固有的和CsA誘導的體外增殖能力及PCNA表達；抑制CsA對血清剝奪誘導的細胞滋養細胞凋亡的保護作用。NFAT抑制劑對細胞滋養細胞的增殖、凋亡無明顯影響。

　　結論

　　（1）CsA呈時間劑量依賴方式活化MAPK/ERK1/2信號通路，促進早孕期人細胞滋養細胞的體外增殖活性與PCNA表達、抑制細胞凋亡。

　　（2）CsA可抑制滋養細胞Ca^2＋/Calcineurin/NFAT信號通路，但此通路不參與CsA對滋養細胞的保護作用。

　　（3）CsA誘導的轉錄因子AP-1、NF-κB活化可能參與CsA對細胞滋養細胞體外生長的調控作用。

　　（4）AP-1、NF-κB可能是CsA活化的細胞滋養細胞MAPK/ERK1/2信號通路下游的轉錄因子。

　　（5）CsA誘導的MAPK/ERK1/2信號活化獨立于NFAT核轉位以及NFAT轉錄活性；CsA抑制的NFAT活性也不依賴于MAPK/ERK1/2信號活性。

　　（6）CsA對細胞滋養細胞的促增殖能力可能不是通過TGFβ介導。

來源期刊：《分子細胞生物學報》2007年 第1期 作者：周雯慧 杜美蓉 董琳 朱曉勇 賀銀燕 李大金

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