環(huán)孢素A自20世紀(jì)70年代應(yīng)用于臨床以來,作為免疫抑制劑發(fā)揮了極其重要的作用;環(huán)孢素A(新山地明)是目前公認的抑制移植排斥反應(yīng)最為有效的藥物。環(huán)孢素A(新山地明)對某些自身免疫性疾病的治療亦已取得一定的療效。正常生理妊娠類似于同種異體移植,胚胎作為自然的同種移植物不受母體免疫排斥是免疫排斥現(xiàn)象的唯一例外,實際上反映母體對胚胎的免疫耐受。而妊娠失敗多因母體對胚胎的免疫排斥所致。
環(huán)孢素A(新山地明)研究通過原代培養(yǎng)早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞及JAR滋養(yǎng)細胞株,在CsA作用下,研究作為自然移植物的細胞滋養(yǎng)細胞生物學(xué)功能及功能基因表達的改變及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。為反復(fù)自然流產(chǎn)等妊娠疾患的治療提供線索。
環(huán)孢素A(新山地明)對早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞增殖與凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制
目的 探討環(huán)孢素A(新山地明)(Cyclosporin A,CsA)對早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞及人滋養(yǎng)細胞腫瘤細胞系JAR增殖與凋亡的調(diào)控作用。
方法 應(yīng)用硅化聚乙酰胺吡咯烷酮(Percoll)密度梯度離心法,分離純化早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞,經(jīng)免疫細胞化學(xué)和流式細胞儀鑒定其純度;采用MTT法評價早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞及人JAR細胞系活力;PCNA-PE單標(biāo)志流式細胞術(shù)分析細胞增殖情況、Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細胞術(shù)分析細胞早期凋亡;通過Western blot觀察pERK1/2的水平;ELISA分析MAP激酶活性。細胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染AP-1-Luciferase、NF-κB-Luciferase、NFAT-Luciferase與Renilla Luciferase-SV40報告質(zhì)粒,采用熒光素酶報告基因雙檢測系統(tǒng)分析各轉(zhuǎn)錄因子的啟動子活性。
結(jié)果
(1)CsA在有效劑量范圍內(nèi)(1×10^-4~1μmol/L)以濃度依賴方式增強早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞活力和PCNA表達;以1.0μmol/L的CsA促進作用最強。CsA濃度達10.0μmol/L時,則抑制細胞滋養(yǎng)細胞的增殖活性;對JAR細胞系呈現(xiàn)類似作用。
(2)TGF-β1、TGF-β2抑制細胞滋養(yǎng)細胞基礎(chǔ)的及CsA誘導(dǎo)的增殖活力,TGF-β1中和性抗體可增強細胞滋養(yǎng)細胞自身或CsA誘導(dǎo)的增殖活力,TGF-β2中和性抗體可增強CsA誘導(dǎo)的細胞滋養(yǎng)細胞增殖活力,對滋養(yǎng)細胞自身的增殖活力沒有明顯影響。而無論TGF-β1、TGF-β2或其中和性抗體對于JAR細胞系的增殖活力均沒有影響。
(3)早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞凋亡率較低,血清饑餓48h后,Annexin V-FITC、PI細胞明顯上升,約為20.34±4.18%(P<0.01),提示滋養(yǎng)細胞凋亡明顯增加。加用不同濃度CsA處理后,滋養(yǎng)細胞凋亡顯著減少,其抑制作用呈劑量依耐關(guān)系。當(dāng)CsA濃度為1.0μmol/L時作用最強,此時細胞滋養(yǎng)細胞早期凋亡率下降至9.54±2.43%(P<0.01)。而CsA濃度達10.0μmol/L時,體外培養(yǎng)的細胞滋養(yǎng)細胞早期凋亡增加至25.7±1.08%。
(4)Western blot、ELISA顯示,CsA以時間和劑量依賴性方式促進細胞滋養(yǎng)細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。U0126預(yù)處理可抑制CsA誘導(dǎo)的細胞滋養(yǎng)細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化。NFAT抑制劑對CsA誘導(dǎo)的細胞滋養(yǎng)細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化無顯著影響。
(5)CsA以時間和濃度依賴性刺激JAR細胞AP1、NF-κB啟動子活性;抑制ionomycin+PMA誘導(dǎo)的JAR細胞NFAT啟動子活化。
(6)MEK激酶抑制劑U0126以劑量依賴方式抑制滋養(yǎng)細胞ERK1/2的磷酸化和MAP激酶的活化的同時,抑制AP1、NF-κB啟動子活性,抑制細胞滋養(yǎng)細胞固有的和CsA誘導(dǎo)的體外增殖能力及PCNA表達;抑制CsA對血清剝奪誘導(dǎo)的細胞滋養(yǎng)細胞凋亡的保護作用。NFAT抑制劑對細胞滋養(yǎng)細胞的增殖、凋亡無明顯影響。
結(jié)論
(1)CsA呈時間劑量依賴方式活化MAPK/ERK1/2信號通路,促進早孕期人細胞滋養(yǎng)細胞的體外增殖活性與PCNA表達、抑制細胞凋亡。
(2)CsA可抑制滋養(yǎng)細胞Ca^2+/Calcineurin/NFAT信號通路,但此通路不參與CsA對滋養(yǎng)細胞的保護作用。
(3)CsA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB活化可能參與CsA對細胞滋養(yǎng)細胞體外生長的調(diào)控作用。
(4)AP-1、NF-κB可能是CsA活化的細胞滋養(yǎng)細胞MAPK/ERK1/2信號通路下游的轉(zhuǎn)錄因子。
(5)CsA誘導(dǎo)的MAPK/ERK1/2信號活化獨立于NFAT核轉(zhuǎn)位以及NFAT轉(zhuǎn)錄活性;CsA抑制的NFAT活性也不依賴于MAPK/ERK1/2信號活性。
(6)CsA對細胞滋養(yǎng)細胞的促增殖能力可能不是通過TGFβ介導(dǎo)。
來源期刊:《分子細胞生物學(xué)報》2007年 第1期 作者:周雯慧 杜美蓉 董琳 朱曉勇 賀銀燕 李大金