Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in hepatitis B virus

　　Jie Yan, Wen Xie, Lei Wang, Jing-Bo Wang, Xin Feng, Shu-Jing Song, Shun-Ai Liu, Hong-Shan Wei

　　Jie Yan, Wen Xie, Xin Feng, Shu-Jing Song, Shun-Ai Liu, Hong-Shan Wei, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China

　　Lei Wang, Jing-Bo Wang, Ji’nan Hospital of Infectious Diseases, Medical College of Shandong University, Ji’nan 250021, Shandong Province, China

　　Supported by the Capital Medical Science Foundation, No. 2002-3046

　　Correspondence to: Jie Yan, Beijing Ditan Hospital, Beijing 100011, China. jieyan@bbn.cn

　　Received: 2006-03-06 Accepted: 2006-03-16

　　Abstract

　　AIM: To establish a simple, accurate and practical method for the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation (rtA181V mutation) in hepatitis B virus.

　　METHODS: Four shares of serum were collected from patients who had been treated with adefovir dipivoxil for more than 1 year, and HBV DNA replication reoccurred. Two pairs of primers were designed to amplify the region of HBV reverse transcriptase codon 181(rt181) in order to introduce a BlpI restriction site upon PCR product of wild type (wt). After amplification, the PCR products were digested with BlpI and then subjected to electrophoresis. The patterns of rtA181V mutation were detected by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis.

　　RESULTS: Of the 4 patients, rtA181V mutation was detected in 2 cases by the above method. The established nest PCR-RFLP assay could detect HBV DNA at the level of 103 copies/L. The result of RFLP analysis was in accordance with that of DNA sequencing.

　　CONCLUSION: The ntPCR–RFLP assay is a rapid, simple, specific and sensitive method for the detection of rtA181V mutation in HBV.

　　Key Words: Adefovir dipivoxil; Hepatitis B virus; Mutation

　　Yan J, Xie W, Wang L, Wang JB, Feng X, Song SJ, Liu SA, Wei HS. Application of nest PCR-RFLP in the detection of adefovir dipivoxil resistance-associated mutation in hepatitis B virus. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2006;14(7):714-717

　　摘要

　　目的:  建立一種簡便、快速、實用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韋(ADV)耐藥變異—rtA181V變異的快速檢測方法.

　　方法:根據(jù)GenBank收錄的HBV基因全序設(shè)計巢式PCR引物, 使野生株(rt181  A)PCR產(chǎn)物中含有BlpⅠ酶切位點(5,GCTNAGC3), 而變異株(rt181V)無此限制性酶切位點. 選取4份應(yīng)用ADV治療1 a以上出現(xiàn)HBV DNA反跳的臨床耐藥慢性乙型肝炎患者血清，經(jīng)PCR擴增、BlpⅠ酶切、30 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析. 并選擇經(jīng)該方法鑒定的野生株及變異株各一例進行HBV  RT區(qū)基因序列分析及對照質(zhì)粒的構(gòu)建.

　　結(jié)果:自4份血清標本中檢測到2例rtA181V變異. 所建立的ntPCR-RFLP方法靈敏度高, 可以檢測到103  copies/L的HBV DNA; 特異性強, 其RFLP分析結(jié)果與DNA測序結(jié)果一致.

　　結(jié)論:應(yīng)用ntPCR-RFLP方法檢測rtA181V變異具有靈敏、特異、簡便的優(yōu)點,  適用于ADV耐藥變異的臨床監(jiān)測工作.

　　 

　　關(guān)鍵詞: 阿德福韋; 肝炎病毒; 乙型; 變異

　　0 引言

　　抗乙型肝炎病毒(HBV)新藥-阿德福韋酯(adefovir dipivoxil, ADV)已經(jīng)國家食品藥品管理局(SFDA)批準在我國上市. 臨床研究表明ADV能有效地抑制HBV DNA復制, 使HBV DNA滴度迅速降低, 而且在出現(xiàn)拉米夫定(lamivudine)耐藥的患者中ADV能繼續(xù)有效地抑制變異株[1-3]. 但隨著ADV的長期應(yīng)用, 目前已發(fā)現(xiàn)該藥亦存在耐藥現(xiàn)象; 現(xiàn)已得到學術(shù)界公認的耐藥株有兩種: rtN236T變異和rtA181V變異[4-5]. 此前我們已建立了基于巢式聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)技術(shù)(ntPCR-RFLP assay)的rtN236T變異快速檢測方法[6].  進一步應(yīng)用該技術(shù)建立用于rtA181V變異的快速檢測方法, 以期對ADV耐藥變異進行更為全面的監(jiān)測.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 4份慢性乙型肝炎(CHB)血清取自北京地壇醫(yī)院及濟南傳染病醫(yī)院就診患者. 4患者均應(yīng)用ADV治療1 a以上, 治療過程中曾出現(xiàn)HBV DNA陰轉(zhuǎn), 此后再次出現(xiàn)HBV DNA反跳.

　　1.2 方法 胃采用異硫氰酸胍一步法提取血清中的DNA.待檢血清50 mL加入含4 mol/L異硫氰酸胍的裂解液60 mL，37℃溫育10 min; g離心10 min; 取上清, 加入等量異丙醇, -20℃沉淀2 h, 13 000 加入酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)50 mL, 震蕩混勻后13 000 mL/L 乙醇50 mL, 13 000 g離心10 min, 棄上清, 室溫干燥后加入雙蒸水20 mL溶解, g離心10 min, 棄上清; 加入600 -20℃保存.

　　rtA181V變異是由于HBV基因組第671堿基由胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T), 從而導致HBV聚合酶B區(qū)rt181氨基酸由丙氨酸(alanine, A)變異為纈氨酸(valine, V)(圖1). 故而以此為基礎(chǔ), 檢索GenBank收錄的HBV基因全序, 采用Primer Premier 5.0及Oligo 6.67軟件輔助分析, 設(shè)計巢式PCR引物(外引物: P1、P2, 內(nèi)引物: rt181up, rt181low); 旨在使野生株(rt181 A)PCR產(chǎn)物中含有BlpⅠ酶切位點(5, GCTNAGC3, ), 而變異株(rt181V)無此限制性酶切位點(圖1, 表1).

　　圖1PCR-RFLP檢測rtA181V變異的設(shè)計. 

　　表1 PCR引物序列 

　　mL 以血清提取物為模板進行巢式PCR反應(yīng): 30 PCR反應(yīng)體系含Taq酶1 U, 10×擴增緩沖液3 mL，25 mol/L dNTP 0. 12 mL、50 mmol/L引物0.12 mL; mL, 引物為P1, P2; 第二輪PCR模板為第一輪PCR產(chǎn)物3 mL, 引物為rt181up, rt181low. 第一輪PCR模板為血清提取物6 s, 53℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共 30循環(huán), 72℃ 7 min. 兩輪PCR循環(huán)條件均為94℃ 3 min, 94℃ 10 取第二輪PCR產(chǎn)物8 mL, 以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, EB染色后于紫外燈下觀察結(jié)果, 于331 bp處出現(xiàn)熒光條帶者為陽性.

　　BlpⅠ酶切: 10 mL酶切反應(yīng)體系內(nèi)含第二輪PCR產(chǎn)物8 mL, BlpⅠ10 U, 酶切緩沖液1 mL, 于37℃酶切4 h. 將全部酶切產(chǎn)物以30 g/L瓊脂糖凝膠電泳, EB染色后于紫外燈下觀察結(jié)果. PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后野生株較變異株缺失21 bp, 故電泳速度稍快.

　　對照質(zhì)粒的構(gòu)建: 同時采用PCR產(chǎn)物直接測序方法對經(jīng)該方法鑒定的野生株及變異株進行HBV RT區(qū)基因序列分析(方法見參考文獻[7], 序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成); 并將上述PCR產(chǎn)物純化后與T-載體(美國Promega公司)連接, 構(gòu)建重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化JM109菌, 經(jīng)雙脫氧末端終止法進行測序鑒定后用作對照質(zhì)粒.

　　2 結(jié)果

　　以不同HBV DNA濃度的血清提取物為模板進行PCR檢測, 終檢濃度為103 copies/L(HBV DNA熒光定量試劑盒購自深圳匹基生物技術(shù)公司), 表明該巢式PCR反應(yīng)具有良好的靈敏度. 陽性標本PCR產(chǎn)物大小與預期值相符(331 bp), 表明該巢式PCR反應(yīng)具有高度特異性.RFLP分析: BlpⅠ酶切后電泳結(jié)果顯示, 4份血清標本中有2份被完全酶切, 為野生株(rt181A); 尚有2份未被酶切, 為變異株(rt181V)(圖2). HBV RT區(qū)基因序列測定結(jié)果與RFLP分析結(jié)果一致(圖3), 并將2條變異株RT區(qū)基因序列提交至GenBank, 其序列號(accession number)分別為: DQ343155、DQ343156.

　　圖2 BlpⅠ酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果. M: 變異型對照質(zhì)粒; W: 野生型對照質(zhì)粒; 1-4: 血清標本.

　　圖3HBV RT區(qū)基因序列測定結(jié)果. A: 野生型對照質(zhì)粒(nt:GCT, aa: A); B:  變異型對照質(zhì)粒(nt: GGT, aa: V).

　　3 討論

　　隨著ADV臨床應(yīng)用時間的延長, 與之相關(guān)的HBV耐藥變異發(fā)生率亦逐年增多, 并且該類耐藥變異的出現(xiàn)可能會導致嚴重的肝臟失代償[8]. 我國HBV慢性感染患者眾多, 在ADV廣泛應(yīng)用之前應(yīng)建立完善的耐藥監(jiān)測體系以指導臨床合理用藥[9], 為此亟待建立一種簡便、快速的ADV耐藥變異檢測方法. 目前得到學術(shù)界公認的耐藥株有兩種: rtN236T變異和rtA181V變異[4-5], 此前我們已建立了基于巢式聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)技術(shù)(ntPCR-RFLP assay)的rtN236T變異快速檢測方法[6]; 為了能夠?qū)�ADV耐藥變異進行更為全面的監(jiān)測, 進一步應(yīng)用該技術(shù)建立用于rtA181V變異的快速檢測方法.

　　在技術(shù)路線方面, 仍采用用于檢測rtN236T變異的ntPCR-RFLP技術(shù)和30 g/L瓊脂糖凝膠電泳; 是因為基于上述技術(shù)的拉米夫定耐藥變異檢測方法已為國內(nèi)眾多實驗室廣泛應(yīng)用, 具有靈敏、特異、簡便、實用之優(yōu)點[10-13], 故而采用該技術(shù)便于在國內(nèi)推廣, 建立全國性的完善的ADV耐藥監(jiān)測體系.

　　目前已有兩種品牌的阿德福韋酯在我國上市, 隨著用藥時間的延長, 已有部分患者出現(xiàn)HBV DNA反跳, 甚至臨床癥狀的加重. 我們應(yīng)用ntPCR-RFLP技術(shù)檢測4例服用ADV 1 a以上出現(xiàn)臨床耐藥的患者血清中HBV變異情況, 發(fā)現(xiàn)2例rtA181V變異和1例rtN236T(將于另文報道); 可見對ADV耐藥變異進行臨床監(jiān)測確系刻不容緩.  

　　4 參考文獻

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