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朱敏俠，劉曉麗，戎浩，李楊，李捷，賀學，盛業萌

　　【摘要】 目的 觀察七十味珍珠丸（RNSP）對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及抗凋亡機制。方法 采用大腦中動脈阻塞模型，實驗分組：假手術組、模型組、溶媒對照組和 RNSP 組。神經功能缺失評分觀察大鼠神經缺失體征，紅四氮唑染色測量腦組織梗死面積，及 Western blot 檢測海馬組織 Bcl-2/Bax 比值和 caspase-3 的蛋白表達。結果 與假手術組比較，模型組大鼠神經缺失體征明顯，腦梗死面積明顯增加，Bcl-2/Bax 比值減小，caspase-3 蛋白表達明顯升高。而與模型組比較，RNSP 組大鼠神經缺失體征明顯改善，腦梗死面積減少，Bcl-2/Bax 比值增大，cas?

　　pase-3 蛋白表達明顯降低。結論 七十味珍珠丸對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用，與其上調 Bcl-2/Bax 比值，減少 caspase-3 蛋白表達的抗凋亡作用有關。

　　【關鍵詞】 腦缺血；再灌注損傷；細胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；七十味珍珠丸

　　缺血性腦卒中是中老年人的常見病、多發病，和心臟病、惡性腫瘤構成人類三大致死性疾病，具有高致死率和高致殘率的特點[1-2] 。長期以來，眾多醫務工作者對腦卒中的預防、發病和預后康復進行著專注而持久的研究，一些藥物也被廣泛地應用于研究當中。藏藥七十味珍珠丸的藏文譯音為然納桑培（Rannasangpei，RNSP），是藏醫最有代表性的名貴珍寶藏成藥之一，是藏醫臨床治療各種急慢性腦血管及神經系統疾病最常用的藥物[3] 。本研究擬觀察七十味珍珠丸對缺血性腦卒中發病機制中腦缺血再灌注損傷的保護作用及其抗凋亡機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物 60 只健康成年雄性 Sprague Dawley 大鼠，40～45 日齡，SPF 級，環境溫度 20～23 ℃，濕度 40%～80%，自由飲水飲食。體質量（200±20）g，實驗動物生產許可證號為 SCXK（滬）2009-0019，購自復旦大學醫學院實驗動物科學部。

　　1.2 藥物與試劑 七十味珍珠丸（西藏自治區藏藥廠，國藥準字 Z54020062）。紅四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC，美國 Ameresco 公司），兔抗大鼠 B cell lymphomaeukemia 2（Bcl-2）抗體和小鼠抗大鼠 Bc1-2 associated X protein（Bax）抗體（1∶1 000；美國 Santa Cruz 公司），兔抗大鼠caspase-3 抗體（1∶1 000；美國 Cell Signaling Technology 公司），小鼠抗大鼠β-actin 抗體（1∶5 000）、HRP 標記抗兔抗體（1∶1 000）和 HRP 標記抗小鼠抗體（1∶1 000；美國 Millipore公司）。

　　1.3 儀器 大腦中動脈阻塞模型栓線-AAAA 級（北京沙東生物技術有限公司），大鼠腦模具（深圳瑞沃德生命科技有限公司），蛋白質免疫印跡法全套設備（美國 Bio-Rad 公司），凝膠成像系統（美國 GE 公司），凝膠分析系統（上海復日科技有限公司）。

　　1.4 方法1.4.1 動物預處理給藥 按照隨機數字表法將大鼠分為 4組：假手術組、模型組、溶媒對照組和七十味珍珠丸藥物（RN?

　　SP）組。將七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸餾水稀釋（終濃度100 g/L），RNSP 組以 RNSP 0.1 mL/kg 灌胃給藥，每天 1 次，連續 7 d，溶媒對照組以蒸餾水灌胃，最后一次灌胃后 1 h 制作模型。

　　1.4.2 局灶性腦缺血再灌注模型的制備 6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位，頸部剪毛，常規消毒皮膚后，參照 Longa線栓法[4] 并加以改進制備大鼠右側 MCAO 模型：先分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈和翼腭動脈，結扎頸外動脈遠心端，近心端穿線打一松結，血管夾暫時夾閉頸內動脈和翼腭動脈，在頸外動脈遠心端結扎線和近心端松結之間剪一小口將栓線插入頸總動脈，拉緊松結的線并將遠心端剪斷，頸外動脈向頸總動脈方向拉直，經頸內動脈插入栓線，插入長度約 18 mm(自頸總動脈分叉處算起)，再灌注時拔出栓線并結扎頸外動脈斷端。本課題選用缺血 40 min 再灌注 24 h 的時間點。假手術組插入栓線 0.5～1 mm，其余操作同模型組。

　　1.4.3 神經功能缺失評分 采用雙盲法對各組動物進行評分記錄，參照 Longa 評分法[4] ，分五級，0~4 分：0 分，無神經系統損害癥狀；1 分，不能完全伸直對側前爪；2 分，向對側轉圈；3 分，行走時向對側傾倒；4 分，不能自發行走，意識喪失。評分錄入電腦并進行統計分析。

　　1.4.4 腦梗死面積測量 麻醉斷頭取腦，腦組織于-20 ℃冷凍約 10 min 后置于腦模具中，每 2 mm 冠狀位切下，連續取 6片腦組織，用 0.1 mol/L PBS 新鮮配制的 2%TTC 溶液避光染色 30 min，最后用 4%多聚甲醛固定 24 h，拍照，用 ImagePro-plus 6.0 (Media Cybernetics, Sliver Spring，MD，USA)圖像分析軟件測量腦梗死面積，并按如下公式計算：腦梗死面積=（切片中梗死面積/全腦面積）×100%。TTC 是檢測細胞活性的常用試劑，可被存活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原生成紅色物質 Formazan，因此，未梗死組織被染為紅色，而梗死組織不著色，呈現白色。每只大鼠的第 4 張腦片的梗死面積納入統計學分析。

　　1.4.5 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗 取大鼠右側海馬組織稱質量，加入裂解液勻漿提取上清，測量蛋白濃度，加入等體積 2×loading buffer 后煮沸 5 min 做變性處理，然后上樣跑電泳。經 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉法電轉移至 PVDF 膜上。將 PVDF 膜置于封閉液中室溫孵育 2 h后，加入一抗工作液，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜 5 min×3 次后，加入 HRP 標記的二抗工作液，室溫孵育 2 h，TBST 洗膜5 min×3 次，ECL 顯影液加于膜上反應 2 min，在凝膠成像系統中選擇合適的曝光時間進行顯影，圖像輸入凝膠分析系統進行分析并保存數據。

　　1.5 統計學方法 實驗所有數據均以 SPSS 17.0 軟件進行分析，實驗數據以x±s表示，采用 One-Way ANOVA 分析，組間多重比較采用 LSD(方差齊)或 Dunnett T3（方差不齊），P<0.05 為差異有統計學意義。

　　2 結果2.1 大鼠神經功能缺失體征 4 組間大鼠神經功能缺失評分差異有統計學意義（F=50.589，P＜0.01，n=8）。假手術組沒有神經功能缺失體征，模型組（2.38±0.18）大鼠神經行為學評分增高，神經功能缺失體征明顯。與模型組比較，RNSP 組（1.5±0.19）大鼠神經行為學評分降低（P＜0.05），而溶媒對照組（2.5±0.19）差異無統計學意義（P＞0.05）。

　　2.2 大鼠腦梗死面積 4 組間大鼠腦梗死面積差異有統計學意義（F=65.091，P＜0.01，n=7）。假手術組沒有梗死，與模型組（37.24±0.93）%比較，RNSP 組腦梗死面積占（22.71±2.79）%，顯著降低（P<0.01），而溶媒對照組腦梗死面積占（35.8±3.10）%，差異無統計學意義（P>0.05）。

　　2.3 Bcl-2/Bax 比值 4 組間 Bcl-2/Bax 比值差異有統計學意義（F=10.877，P<0.01，n=5）。與假手術組（1.00 ± 0.00）比較，模型組 Bcl- 2/Bax 比值（0.72 ±0.06）減小，與模型組比，RNSP 組該比值（1.02±0.06）增大（均 P<0.01），而溶媒對照組（0.68±0.07）差異無統計學意義（P>0.05），見圖 2。

　　2.4 caspase-3 表達 4 組間 caspase-3 表達差異有統計學意義（F=17.191，P<0.01，n=5）。與假手術組（1.00±0.00）比較，模型組該蛋白表達（1.22±0.04）增多，與模型組比，RNSP 組該蛋白表達（0.74±0.10）減少（均 P<0.05），而溶媒對照組（1.30±0.06）差異無統計學意義（P>0.05）。

　　3 討論缺血性腦卒中的發病原因在于腦的主要供血動脈狹窄或閉塞，疾病發展過程中或后期治療時局部閉塞的血管再通，從而發生腦缺血再灌注損傷。實驗研究中，MCAO 模型是模擬缺血性腦卒中的常用動物模型，線栓法制作 MCAO 模型自 1989 年 Longa報道后廣為所用，該模型具有操作簡單、損傷小、無需開顱的特點，經過大量的實驗研究發現，皮質、紋狀體、海馬和丘腦等都是易損區[4-5] 。鑒于海馬對于學習、記憶及腦功能的重要性，本課題采用線栓法制作 MCAO 模型來觀察七十味珍珠丸對缺血性腦卒中的保護作用及發病過程中海馬組織凋亡相關蛋白的表達變化。

　　近年來研究表明，腦缺血再灌注損傷后神經元細胞凋亡是細胞死亡的重要方式[6] 。細胞凋亡過程受到一系列相關基因的調節和控制，主要有 Bcl-2家族、Fas、C-myc、p53 和 caspase 家族等。目前在缺血/再灌注中研究較多的是 Bcl-2 家族成員，包括抗凋亡蛋白，如 Bcl-2 和 Bcl-XL，和促凋亡蛋白，如Bad、Bid、Bik、Bax 和 Bak。它們的許多家族成員都位于線粒體外膜，它們調節細胞死亡的機制可能是與其調節線粒體膜上通透性轉換孔，改變線粒體膜的通透性有關。線粒體膜的通透性增加時，細胞色素 C 可釋放入胞漿，并與凋亡激活因子（Apaf）結合引起后者構象改變，最后激活 caspase-9，轉而激活caspase-3 等一系列級聯反應，導致凋亡的發生[7-8] 。

　　抗凋亡蛋白 Bc1-2 分子質量為 25～26 ku，人類 Bax 蛋白分子質量為 21 ku，與 Bc1-2 的同源性為 21%，故稱 Bax 為 Bc1-2 家族成員。Bax 是該家族中研究比較深入的，也是最具有代表性的促凋亡蛋白。Bax 可與 Bcl-2 形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。當 Bax 超表達時，自身形成同源二聚體，細胞對凋亡信號的反應增強，細胞凋亡增多，當Bc1-2 超表達時，它與 Bax 形成異源二聚體，凋亡被抑制，因此，Bc1-2 和 Bax 的比值決定了細胞凋亡的敏感性[9-10] 。本實驗中，與假手術組比，模型組 Bcl-2/Bax 比值減小，而七十味珍珠丸可增加 Bcl-2/Bax比值。

　　Caspase 家族是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，與細胞凋亡關系密切，凋亡的最后實施是通過 caspase 的激活而實現的，而 caspase-3 為該級聯反應的下游關鍵因子，在各種啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用[9-11] 。在缺血性腦卒中模型中發現caspase-3 明顯上調，且在腦缺血及腦缺氧-缺血損傷保護作用的研究中也發現，缺血預處理和藥物保護等措施可通過減少細胞色素 C 的釋放和 caspase-3 的激活來減少神經細胞凋亡[12-14] 。本研究結果也表明，模型組海馬組織 caspase-3 表達較假手術組明顯增多，而七十味珍珠丸藥物組 caspase-3 蛋白表達減少。

　　RNSP 主要由佐太、天然珍珠、天然牛黃、羚羊角、麝香、藏紅花等七十余味名貴藏藥組成，該藥在臨床和實驗研究中受到廣泛關注。在臨床應用方面主要是治療卒中偏癱、阿爾茨海默病、高血壓，癲癇、腦震蕩、風濕性關節炎、植物神經功能紊亂和腦出血等[15- 19] 。在實驗研究方面主要用于鎮靜[20] 、抗驚厥[21] 、改善學習記憶[22] 、改善微循環血流[23] 、抗血栓形成[24] 、急性腎性高血壓中的降壓[25] 和腦血管疾病防治[23-24] 等方面。腦缺血研究方面顯示：七十味珍珠丸對腦缺血疾病有類似阿司匹林的抗血栓作用，且效果強于阿司匹林，對大腦動脈血栓引起的局部缺血所致的行為障礙有改善作用，減少了腦梗死面積以及腦組織的病理學改變，說明該藥對腦缺血有保護作用[24] 。通過本研究進一步表明七十味珍珠丸可減少神經缺失體征和腦梗死面積，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，該作用與其抗凋亡機制相關，為臨床上七十味珍珠丸預防和治療缺血性腦卒中提供了更堅實的理論依據。

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