反復(fù)自然流產(chǎn)與精子DNA完整性的相關(guān)性

　　反復(fù)自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion, RSA）的發(fā)生率為1%-5%,其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，可能與解剖異常、免疫失調(diào)、內(nèi)分泌紊亂、染色體異常、感染及基因多態(tài)性等有關(guān)，由于其發(fā)病原因不明，給臨床治療帶來(lái)困難[1-4].

　　精子DNA是精子遺傳物質(zhì)的載體，近年來(lái)的研究表明精子DNA的完整性能夠影響精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的發(fā)育[5-7].為了評(píng)估精子DNA完整性在反復(fù)自然流產(chǎn)中的可能作用，我們對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫精子DNA完整性和正常生育男性精子DNA完整性進(jìn)行了檢測(cè)，并比較了兩組間在精子DNA完整性和精液常規(guī)方面的差異。

　　目的：探討反復(fù)自然流產(chǎn)與精子DNA完整性的相關(guān)性。方法：按納入標(biāo)準(zhǔn)將研究對(duì)象分成反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫組（n=58）和正常生育男性對(duì)照組（n=50），采用吖啶橙實(shí)驗(yàn)（AOT）對(duì)研究對(duì)象精子DNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)研究對(duì)象精液進(jìn)行常規(guī)分析。結(jié)果：兩組研究對(duì)象年齡、吸煙史、飲酒史無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫組精液的精子密度、精子活力顯著低于正常生育對(duì)照組（P<0.05）；反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫組精子DNA的完整性低于正常生育對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：精子DNA完整性損傷是反復(fù)自然流產(chǎn)的可能原因，精子DNA完整性損傷導(dǎo)致反復(fù)自然流產(chǎn)的致病機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

　　1 對(duì)象與方法1.1 研究對(duì)象 本組58例反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫（反復(fù)自然流產(chǎn)組），年齡25-36歲，來(lái)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院男科門(mén)診；50例正常生育男性自愿者作為對(duì)照組（正常對(duì)照組），年齡24-33歲，其配偶至少有一次生育史且無(wú)自然流產(chǎn)史。反復(fù)自然流產(chǎn)患者的納入標(biāo)準(zhǔn)參照Buchholz等[8]的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)研究對(duì)象的年齡、飲酒史、吸煙史等基本資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以平均每日吸煙超過(guò)10支，連續(xù)吸煙6個(gè)月及以上為吸煙，以平均每日飲酒量50 mL（純乙醇量），連續(xù)6個(gè)月及以上為飲酒。

　　1.2 主要試劑與儀器 WLJY-9000偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），吖啶橙（美國(guó)Sigma公司）。

　　1.3 標(biāo)本采集 受檢者應(yīng)禁欲3-7 d,用手淫或體外排精法收集一次排精的全部精液，留于清潔收集器皿內(nèi)，標(biāo)明采集時(shí)間，置37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，液化后進(jìn)行精液常規(guī)分析。

　　1.4 精液分析 采用國(guó)產(chǎn)WLJY-9000偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)軟件配合載物臺(tái)溫控儀以及計(jì)算機(jī)操作，參照《WHO人類(lèi)精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》[9]對(duì)精子密度、精子活力和精子活力分級(jí)進(jìn)行分析。

　　1.5 精子DNA完整性檢測(cè) 采用吖啶橙實(shí)驗(yàn)（acridine orange test, AOT）染色對(duì)精子DNA完整性檢測(cè)[10].將液化后精子進(jìn)行精液分離，1 500 r/min離心10 min,去除精漿，以37 ℃ 0.01 mol/L PBS液洗滌沉淀3次，將精子制備為精子懸液，然后將精子懸液涂片，風(fēng)干后以Carnoy液（3份甲醛與1份冰醋酸混合）固定過(guò)夜；固定后的精子涂片以吖啶橙染液染色5 min,蒸餾水洗片3次，風(fēng)干后行熒光顯微鏡檢（放大400倍，激發(fā)波長(zhǎng)為460 nm）。為了保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，染色后的精子涂片須立即觀(guān)察，防止熒光淬滅。經(jīng)染色后，正常精子DNA呈雙鏈在激發(fā)光下呈綠色，而變性或受損的精子DNA則斷裂為單鏈呈黃色或紅色。在熒光顯微鏡光鏡同一視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)精子，以異常精子所占的百分比來(lái)表示精子DNA受損程度。

　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié) 果2.1 研究對(duì)象基本情況 對(duì)研究對(duì)象基本資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以平均每日吸煙超過(guò)10支、連續(xù)吸煙6個(gè)月及以上為吸煙，以平均每日飲酒量50 mL（純乙醇量），連續(xù)6個(gè)月及以上為飲酒。兩組患者在年齡、飲酒史、吸煙史等方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05,表1）。 表1 研究對(duì)象的基本狀況2.2 精子活力檢測(cè)結(jié)果 反復(fù)自然流產(chǎn)組和正常生育對(duì)照組精子密度及活力檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2.

　　2.3 精子DNA完整性檢測(cè)結(jié)果 反復(fù)自然流產(chǎn)組和正常生育對(duì)照組精子DNA受損程度分別為（75.4±7.5）%和（30.2±5.8）%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表2 反復(fù)自然流產(chǎn)組和正常生育對(duì)照組精子密度及活力3 討 論反復(fù)自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見(jiàn)病。近年來(lái)的研究表明其可能與解剖異常、免疫失調(diào)、內(nèi)分泌紊亂、染色體異常、感染及基因多態(tài)性等有關(guān)，但是其確切病因尚不清楚。

　　常規(guī)的精液分析能夠從精子密度、精子活力和精子形態(tài)等方面反映精液質(zhì)量，但是其在精子功能的評(píng)價(jià)方面價(jià)值有限，不能直接反映精子受精能力和對(duì)胚胎發(fā)育的影響。近年來(lái)的研究表明精子DNA的完整性與精子活力、精子形態(tài)及精子功能有顯著相關(guān)性，并且可以影響受精卵的分裂以及胚胎的發(fā)育[5-7].精子DNA是遺傳信息的載體，精子DNA的完整性對(duì)種族的繁衍具有重要意義，但是精子生成過(guò)程中染色質(zhì)的濃縮異常、受損精原細(xì)胞的凋亡異常、環(huán)境毒物以及不良的生活習(xí)慣都會(huì)造成精子DNA損傷。

　　吖啶橙是一種熒光絡(luò)黃染料，具有高度的異染性，吖啶橙以插入的方式與雙螺旋的DNA分子結(jié)合；在激發(fā)波照射情況下，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)呈單體形式發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合時(shí)呈聚合物形式發(fā)出紅色或黃色熒光[11].而精子DNA損傷的特征性改變?yōu)榫�子DNA單鏈形成和雙鏈斷裂[12],所以吖啶橙實(shí)驗(yàn)被用來(lái)檢測(cè)精子DNA損傷。精子經(jīng)吖啶橙染色后，可以采用熒光顯微鏡檢或流式細(xì)胞儀對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判定，由于熒光顯微鏡檢操作簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)而被廣泛使用[13].

　　本研究為了探討精子DNA完整性在反復(fù)自然流產(chǎn)中的可能作用，對(duì)反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫和正常生育對(duì)照男性精子DNA完整性進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)研究對(duì)象精液進(jìn)行了常規(guī)分析。研究結(jié)果表明反復(fù)自然流產(chǎn)組精子DNA完整性顯著低于正常對(duì)照組，而且反復(fù)自然流產(chǎn)組精子密度和精子活力也顯著低于正常對(duì)照組，但是精子DNA完整性受損是否是導(dǎo)致精子密度和精子活力下降的原因尚不清楚。

　　綜上所述，精子DNA完整性與反復(fù)流產(chǎn)有顯著的相關(guān)性，并且反復(fù)自然流產(chǎn)患者丈夫精液常規(guī)存在異常。然而，精子DNA完整性損傷導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的致病機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

　　參考來(lái)源：《反復(fù)自然流產(chǎn)與精子DNA完整性的相關(guān)性研究》吳大鵬，吳齊飛，李旭東，《現(xiàn)代泌尿外科雜志 》2008年第12卷第2期

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