北京地壇醫院傳染病研究所     魏紅山 成軍

 

    2005年12月我國第一部《慢性乙型肝炎防治指南》頒布,2006年1月衛生部頒布了《2006-2010年全國乙型病毒性肝炎防治規劃》。其目的在于科學、規范和有效開展我國乙型肝炎防治工作。衛生部計劃在未來3~4年內逐步建立全國乙型肝炎實驗室檢測網絡,制定《全國乙型肝炎實驗室檢測工作技術規范》,加強實驗室網絡人員培訓,提高乙型肝炎的實驗室診斷水平。以下就目前我國開展的乙型肝炎實驗室診斷技術及其質量控制進行簡要概述。

 

    乙型肝炎標志物檢測

 

    1. 方法與原理 乙型肝炎標志物檢測目的在于確認患者是否感染乙型肝炎病毒(HBV),是乙肝實驗室診斷中最常用的檢測方法。目前臨床應用的主要方法有:①免疫熒光技術:由于熒光標記的抗原(或抗體)受血清成分等本底因素影響過大而應用較少。在此技術上改進的時間分辨免疫熒光法(TRFIA),延長了熒光壽命,降低了本底因素影響,特異性和穩定性都有顯著提高,對HBsAg檢測下限為0.35~0.5 ng/ml。②固相放射免疫法:靈敏度較免疫熒光提高100~1000倍,檢測低限達pg水平,但因同位素穩定性差、對環境造成污染等原因也很少用于臨床乙型肝炎標志物檢測。③酶聯免疫吸附試驗(ELISA)技術:是目前國內最為常用的乙型肝炎五項檢測方法。該方法檢測HBsAg靈敏度下限為0.5 ng/ml。④微粒子酶免法(MEIA):是近年來新發展起來的一種新的抗原抗體檢測技術,該方法對HBsAg檢測靈敏度為0.17~0.2 ng/ml。

 

    2. 質量控制 衛生部臨床檢驗中心從1988年開始在全國范圍內開展乙型肝炎標志物檢驗的質量評價活動,并制定了臨床檢驗中心室間質量評價方案(EQA)。但實驗操作人員的主觀性使EQA成績難以真實反應一個實驗室的檢測水平。因此有效的室內質控對保證日常檢驗結果的準確性更有意義。

 

    ELISA試驗中,2倍標準差(2SD)是一般公認的允許誤差限度。每批測定放一份質控血清時,一次超過2SD應作為“告警”,二次超出2SD為“失控”。當質控過程中出現失控時應查找原因,通常是試劑盒或質控血清失效造成。對更換試劑盒或更換質控血清仍然難以明確原因的應該進行最佳條件下已知值質控血清變異(OCV)檢驗。如果OCV檢驗的結果仍在正常范圍,提示實驗操作存在問題。雙抗體夾心法測定抗原是基于待檢抗原在固相抗體和酶標抗體間的橋接作用, 一步法測定HBsAg 時,如標本中HBsAg 濃度過高,則因競爭抑制作用, 難以形成“夾心復合物”,出現顯色變淺甚至不顯色的現象,稱為HOOK現象,導致HBsAg的漏檢。國內資料顯示,一步法檢測HBsAg的漏檢率為0.47%。兩步法,尤其是TRFIA檢測法可最大限度地避免HBsAg的漏檢。

 

    HBV DNA定量檢測

 

    1. 方法與原理 HBV定量檢測目的在于明確乙型肝炎患者的病毒復制水平、判斷患者病情、抗病毒療效,對預后判定有一定的價值。目前用于HBV DNA的檢測方法主要有兩類:一類是以PCR為基礎,如實時熒光定量PCR。另一類是以核酸雜交為基礎,如斑點雜交和分枝DNA(bDNA)技術等。斑點雜交以定性檢測為主,敏感性較差。實時熒光定量PCR技術是目前國內醫療機構應用最為廣泛的檢測方法。該反應體系內使用的標準品和內標為體外制備的質粒,酶切、純化后-70 ℃保存效期為6年。國產試劑在檢測靈敏度(104 拷貝/ ml) 、測定范圍(104~108拷貝/ml) 等方面已基本達到國外同類產品水平。

 

    2. 檢測低水平復制HBV HBV感染時間超過30年的患者,隨著感染時間的延長,HBV血清標志物濃度也逐漸降低(HBsAg < 0.5 ng/ml),對這部分人群聯合應用HBV DNA定性檢測有助于HBV感染的診斷。

 

    3. 質量控制 鑒于基因診斷操作較為復雜并要求嚴格質控,2005年末,衛生部臨床檢驗中心已經對全國近500家三級醫院的PCR實驗室進行了認證和評估,并針對國內HBV核酸診斷試劑包裝小、效期短、批號更換頻繁的現狀,每年開展2次室間質評。這在一定程度上提高了HBV DNA定量檢測的水平,但對一個實驗室每年2次的室間質評顯然不能保證結果的準確性,對實驗報告而言室內質控更為重要。

 

    PCR實驗室室內質量控制旨在監測和控制實驗室結果的精確度,以決定HBV DNA定量檢測的報告能否發出。以下幾個要點有助于完善室內質控:①質控值在均數±3SD以上的檢測數據為質控失控,不能發送檢測報告,立即查找原因,如質控品失效、污染等。②對于質控值在均數±2SD之內的數值變化應該注意規律,如果出現質控曲線的定向“漂移”現象,連續幾天質控數值向一側偏離,應該及時核查質控血清效期、試劑效期。③每個試劑批號的室內質控曲線分析、每個月室內質控曲線分析,有助于早期發現室內質控可能出現的問題。④制定規范并嚴格執行標準操作規程。

 

    4. HBV cccDNA檢測 HBV共價閉合環狀DNA (cccDNA) 是HBV基因組復制中間體mRNA和前基因組RNA的合成模板,是HBV持續感染的關鍵。近年來有關HBV cccDNA研究逐漸增多。但迄今為止,國內普遍應用的是實時熒光PCR定性試劑,尚無診斷試劑用于臨床。

 

    HBV耐藥檢測

 

    1. 原理及方法 目前多數臨床資料認為,乙型肝炎患者拉米夫定治療過程中HBV出現YMDD變異是HBV 耐藥的轉折點,因此YMDD變異檢測已漸趨普遍。主要的檢測方法有:①PCR擴增法:PCR擴增-限制性酶切片斷多態性分析(PCR-RFLP)是目前國內實驗室最常用的YMDD變異、rtA181V阿德福韋酯耐藥、BCP區變異位點的檢測方法。實時熒光PCR擴增是近期國內應用較多的HBV耐藥檢測方法。②基因芯片分析:包括流體芯片技術、探針雜交技術,主要通過逆向斑點雜交技術實現對變異位點的檢測。③焦磷酸測序法:對YMDD突變質粒及血清標本的重復性及可靠性檢測顯示,質粒標準品的突變檢出率及重復率為100%,而血清標本為98.8%。④基因克隆與測序:采用特異性引物對YMDD所在目的片斷進行克隆后測序,通過與標準株的比較識別變異位點。這是所有檢測方法中最為客觀的檢測方法,但操作復雜、成本高、耗時長是該方法的主要缺陷。

 

    2. 質量控制 上述核酸檢測的室內質控目前主要采用內標技術,除少數實時熒光PCR技術試劑外,多數試劑目前國家藥物食品管理局尚未批準用于臨床檢測,標準品制備尚未規范化管理,室間質評因此未能進行。

 

    3. 耐藥結果解讀 盡管目前多數學者認為YMDD變異是確定核苷類似物停藥的基本參考指征,但近期韓國學者對740例接受拉米夫定治療的乙型肝炎患者HBV編碼蛋白MALDI-TOF質譜分析顯示,整個治療過程中均可檢測到YMDD變異的存在。研究者認為低水平YMDD變異的存在并非預示HBV DNA復制的再次活躍,與野生株相比,5倍的YMDD變異則高度提示HBV DNA復制的再次活躍。研究提示,對耐藥位點的檢測結果需要充分考慮HBV準種對檢測結果的影響。

 

    HBV 基因分型檢測

 

    根據目前的研究資料,亞洲尤其是東南亞HBV基因型與感染者預后相關。日本和我國臺灣地區的研究資料顯示,HBV基因型除與感染的地域有關外,也與感染者預后和肝損傷程度相關。如B型HBV感染者肝損傷程度和纖維化程度相對較輕,但肝癌發病年齡相對比C型提前5~10年。基因分型檢測方法與基因變異檢測基本相同,目前國內沒有商用試劑盒可用。室內質控和室間質評也有待規范。

 

    2003年2月,國際標準化組織針對醫學實驗室制訂了《醫學實驗室質量和能力專用要求》(ISO15189)。醫院實驗室出具的檢測結果是否準確,能否達到相關實驗室的互認或參考,不是簡單地統一各實驗室的檢測儀器、試劑、檢測步驟,而是通過各個實驗室按照ISO15189標準對實驗室認可來實現的。因此,規范實驗室管理,全面提高整體實驗室管理水平是真正實現實時質控、提升檢測質量的關鍵。