扶正化瘀方對肝纖維化大鼠彈力蛋白酶表達的影響

  　迄今為止，對彈力蛋白酶是否參與肝纖維化的形成與降解過程知之甚少。細胞外基質(zhì)（ECM）的彈力纖維隨著肝纖維化的進展逐漸增加[1]。我們曾報道正常大鼠肝細胞、肝竇壁內(nèi)皮細胞等均有彈力蛋白酶mRNA表達[2]。本研究進一步觀察了彈力蛋白酶在肝纖維化組織中的表達以及抗肝纖維化藥扶正化瘀方對彈力蛋白酶表達的影響。
　　

    一、材料與方法
　　1. 肝纖維化動物模型及扶正化瘀方制備：Wistar雄性大鼠，140～160g，造模方法詳見文獻[3]。扶正化瘀方藥物組成同國家三類新藥扶正化瘀膠囊（國藥準字號20020073），配制成含生藥0.369g/ml的混懸液。
　　2. 彈力蛋白酶Ⅱ探針制備及原位雜交：以大鼠胰腺絲氨酸彈力蛋白酶ⅡmRNA堿基排列中第271～288與第776～795之間的核苷酸作為引物，制成地高辛素標記的RNA探針進行原位雜交，具體方法參見文獻[2, 4，5]。
　　3. 胰腺彈力蛋白酶蛋白印跡雜交及其活性測定：肝組織總蛋白30μg以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，兔抗豬彈力蛋白酶抗體反應。活性測定方法參見文獻[6]。
　　4. 其他：Jamall氏法測定肝組織羥脯氨酸（hydrox-yproline, Hyp）；維多利亞藍染色法行彈力纖維染色；天狼星紅染色法行膠原纖維染色。膠原纖維增生程度按文獻[7]方法進行分期半定量判斷。
　　5. 統(tǒng)計學處理：用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，計數(shù)資料用Radit分析。
　　

    二、結果（略）
　　

    三、討論
　　肝組織Hyp含量、肝組織病理學、肝功能及大體病理均表明二甲基亞硝胺可制備大鼠肝纖維化模型。由于使用正義探針原位雜交呈陰性反應，證明所制備的反義探針是成功的[2]。本研究進一步證實在正常大鼠肝組織中，不僅有彈力蛋白酶mRNA表達[2]，同時有彈力蛋白酶蛋白及其活性表達。
　　肝纖維化模型大鼠肝組織彈力纖維、膠原纖維及Hyp含量均有明顯增加，與此同時，假小葉內(nèi)肝細胞的彈力蛋白酶的mRNA表達及肝組織中的彈力蛋白酶活性有所減少。提示二甲基亞硝胺通過抑制彈力蛋白酶表達，破壞了ECM合成與降解的動態(tài)平衡，導致ECM代謝過程中合成大于降解，從而促進了肝纖維化的形成。由于扶正化瘀方組大鼠肝組織彈力蛋白酶mRNA及其活性表達介于正常組與模型組之間，其肝纖維化程度也居于上述兩組之間，提示扶正化瘀方藥物也許通過上調(diào)彈力蛋白酶表達促進了肝纖維化的降解，從而在某種程度上阻止了肝纖維化的進一步形成。彈力蛋白酶mRNA、蛋白及其活性在各組間的表達強度基本一致、并與各組肝纖維化的程度呈反比關系，據(jù)此可以初步認為彈力蛋白酶是保持ECM代謝動態(tài)平衡的因素之一，參與了肝纖維化形成與降解的代謝過程。
既往研究表明，扶正化瘀方抗肝纖維化的作用機制主要有拮抗肝星狀細胞的活化、影響膠原代謝酶活性以促進膠原降解，同時具有抗肝竇毛細血管化、抗肝損傷、保護肝細胞的作用[8]。肝星狀細胞表達彈力蛋白的功能優(yōu)于肝細胞[9]，據(jù)此可推測扶正化瘀方通過拮抗肝星狀細胞的活化，在影響膠原纖維代謝的同時，也影響了彈力纖維的代謝，使得金屬蛋白酶與絲氨酸彈力蛋白酶協(xié)同作用，抑制了肝纖維化的進展。
　　本研究初步證實彈力蛋白酶在一定程度上參與了肝纖維化形成與降解的代謝過程，扶正化瘀方通過上調(diào)彈力蛋白酶表達可在某種程度上抑制肝纖維化的進一步形成。

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