志苓膠囊（ZLJN）藥效學(xué)試驗表明，該藥對小鼠宮頸癌U14、Lewis肺癌抑制率均在50％以上。本研究進(jìn)一步觀察志苓膠囊在體外對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446增殖及誘導(dǎo)凋亡影響，旨在探討其作用機(jī)制，為志苓膠囊臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

    肺癌是威脅人類生命的常見病，其中小細(xì)胞肺癌約占肺癌總發(fā)病率的25％，兩年生存率僅5％。志苓膠囊（ZLJN）藥效學(xué)試驗表明，該藥對小鼠宮頸癌U14、Lewis肺癌抑制率均在50％以上。本研究進(jìn)一步觀察志苓膠囊在體外對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446增殖及誘導(dǎo)凋亡影響，旨在探討其作用機(jī)制，為志苓膠囊臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
  
材料和方法 
    1 藥物 志苓膠囊是由16味中藥和5種西藥組成，即黃芪、女貞子、黃精、北沙參、麥冬、黨參、白術(shù)、茯苓、白毛藤、絞股藍(lán)、仙鶴草、遠(yuǎn)志、陳皮、山藥、芡實、甘草、吲哚美辛、醋酸地塞米松、螺內(nèi)酯、法莫替丁、地西泮。每粒0.43g，其中志苓膠囊中藥生藥含量1.86g／粒，西藥含量23.95 mg／粒，由福州市第一醫(yī)院、福州志苓醫(yī)藥研究所提供。按照每粒膠囊的純中藥和西藥含量比例，分別用二甲基亞砜（DMSo）溶解后，配制成不同濃度母液，4℃保存?zhèn)溆谩?nbsp;
   
    2 試劑及儀器 試劑及試劑盒：二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；RPMI 1640（Gibco-BRL）；MTT（Sigma）；RNaseA （Amresco）；蛋白酶K（Am-resco）；Bcl-2單克隆抗體（Ancel1）；MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測試劑盒（Biovision）；CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase-3 Staining Kit（Biovision）；Cell Cycle Test Plus DNA Reagent Kit（Beckton Dickinson）；AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒（Beckton Dickin-son）；DeadEndTM Colorimetric TUNEL System 試劑盒（Promega）。儀器：酶標(biāo)儀（STAT FAx）；流式細(xì)胞儀（BD FACScan）；凝膠圖像分析儀（BIO-RAD）。 
  
    3 細(xì)胞及培養(yǎng)體系 選擇Bcl-2高表達(dá)的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H446（引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫）作為研究對象，置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、飽和濕度、5％CO2條件下傳代培養(yǎng)。用含0.25％的胰酶和0.03％ 的EDTA 消化液消化貼壁細(xì)胞。收集處于70％～80％融合，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。 
   
    4 藥物分組 藥物按其在培養(yǎng)體系體積百分比濃度分為3組，依次為A組：0.1％DMSO組、0.4％中藥組、0.1％ 西藥組以及后兩者組成的復(fù)方組；B組：0.2％DMSO組、0.8％ 中藥組、0.2％ 西藥組以及后兩者組成的復(fù)方組；C組：0.4％DMSO組、1.6％中藥組、0.4％西藥組以及后兩者組成的復(fù)方組，以上A、B、C組用于MTT法檢測細(xì)胞存活率和集落形成試驗，再選擇其中最佳濃度組進(jìn)行其他實驗。 

    5 實驗方法 
    5.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖 NCI-H446初濃度為1.0×10^5/mL，按以上分組接種于96孔培養(yǎng)板。24h后加藥，每組重復(fù)3個平行孔，每孔100uL。用藥48h后，每孔加5mg/mL MTT 10uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸去上清，每：fLeD 100uL DMSO，在酶標(biāo)儀上充分震蕩混勻，雙波長492 nm和630 nm 比色。細(xì)胞存活率=（實驗組OD值／對照組OD值）×100％。 
     
    5.2 集落形成試驗 調(diào)整細(xì)胞初濃度為1.33×10^2/mL，按以上分組接種于6孔板，每組重復(fù)3個平行孔，每孔1.5mL（約接種200個細(xì)胞），常規(guī)培養(yǎng)24h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)14天后顯微鏡下計算細(xì)胞數(shù)大于40個的細(xì)胞團(tuán)為一個集落，對照組集落形成率大于40％者實驗有效。集落形成率=（各組集落數(shù)/200）×100％ 
   
    5.3 線粒體跨膜電位改變檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10^5/mL，接種于培養(yǎng)瓶，24 h后加藥，收集藥物作用24 h后的細(xì)胞，按照線粒體凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。 
   
    5.4 Caspase-3活性檢測 藥物處理細(xì)胞24 h后，按300uL細(xì)胞懸液加1uL FITC-DEvD-FMK，37℃，5％co2孵育30～60min。用Wash Buffer重懸細(xì)胞2次后加300uL Wash Buffer，混勻，置于冰上，流式細(xì)胞儀分析Caspase-3活性變化。 
   
    5.5 DNA片段化檢測 藥物作用于NCI-H44648h后，約在5.0×10^5細(xì)胞中加20uL細(xì)胞裂解液[20 mmol／L EDTA，100 mmol／L Tris，0.8％（W／V）SDS]，混勻，加500 U／mL RNaseA 10uL，置37℃ 水浴30～120 min，再加入20 mg／mL蛋白酶K 10uL,50℃水浴過夜。2.0％瓊脂糖凝膠電泳，35V，3h，凝膠圖像分析儀上分析結(jié)果。 
    
    5.6 DNA倍體分析 藥物作用細(xì)胞48h后，按照說明書步驟操作。用Buffer Solution重懸細(xì)胞3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10^6/mL，依次加SolutionA、B，分別孵育10 min，最后加Solution C，混勻，冰上孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。 
   
    5.7 Annexinv-FITC檢測 藥物作用6 h后，用1×binding buffer調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10/mL，吸取100uL加入5uL AnnexinV-FITC和5uL PI試劑，室溫放置暗處15 min，再加入400uL 1×bindingbuffer，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。 
   
    5.8 TdT 酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測 收集各藥物組作用48h后的細(xì)胞，涂片，干燥后用4％低聚甲醛固定，參照文獻(xiàn)進(jìn)行操作，顯色后鏡下觀察，細(xì)胞核染成棕褐色者為凋亡細(xì)胞，計數(shù)1000個細(xì)胞，計算凋亡率。 
   
    5.9 Bcl-2蛋白表達(dá)檢測 藥物作用于NCI-H446 48h后，消化細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)應(yīng)在5.0×10^5左右。PBS（pH 7.4）洗滌2次后，2％中性甲醛室溫固定30min，0.3%皂素滲透5min，棄上清。加1:50稀釋的鼠抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體，冰上孵育45min，PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)陽性率。 
   
    6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。單因素方差分析比較各組間差異。
  
結(jié)果 
    1 各組對NCI-H446細(xì)胞增殖比較 不同濃度的中藥組、西藥組和復(fù)方組與NCI-H446共培養(yǎng)48h，加藥組吸光度值與對照組比較差異均有顯著性（P<0.005），細(xì)胞生長明顯受到抑制，除中藥組外，這一抑制作用隨西藥組和復(fù)方組濃度的升高而增強(qiáng)，C組復(fù)方藥物（志苓膠囊）作用后細(xì)胞存活率僅40.5%，幾乎未見活細(xì)胞。 
   
    2 各組對NCI-H446細(xì)胞集落形成比較 志苓膠囊可顯著降低NCI-H446細(xì)胞集落形成率（48.17±1.76）%，A組中藥、西藥、復(fù)方組集落形成率分別為（46.33±1.04）%、（4.67±0.76）%和（4.50±0.50）%，B組分別為（8.17±0.76）%、（2.83±0.29）￥和（0.86±0.29）%，與對照組比較均有顯著性（P<0.05）。C組（志苓膠囊）均為見有集落形成。  
  
    3 各組線粒體跨膜電位比較 C組藥物作用24h后，對照組線粒體跨膜電位下降的細(xì)胞數(shù)很少，占0.04%，中藥組、西藥組分別為1.63%、7.54%，復(fù)方志苓膠囊組線粒體跨膜電位下降的細(xì)胞數(shù)明顯增多，占22.06%。 
  
    4 Caspase-3活性檢測 C組藥物作用24h后，DMSO對照組Caspase-3活性增高細(xì)胞數(shù)較低，占16.51%，中藥組和復(fù)方組細(xì)胞Caspase-3活性依次增高，分別為26.88%，42.96%和78.52%。 
  
    5 DNA片段化分析 C組藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，DNA片段化分析結(jié)果顯示，西藥組和復(fù)方組處理的細(xì)胞有凋亡特征性DNA改變，即形成典型的DNA降解梯狀帶，其中復(fù)方志苓膠囊組誘導(dǎo)DNA梯狀帶形成的作用更加明顯，中藥組則較弱。 
  
    6 DNA倍體分析 C組藥物作用NCI-H446 48h后，各組均檢測到明顯的亞二倍體G1峰（凋亡峰），中藥、西藥及復(fù)方組凋亡率分別為37.67%，42.37%及55.84%。 
   
    7 AnnexinV-FITC檢測細(xì)胞凋亡 C組藥物作用6h即可檢測到早期凋亡細(xì)胞，對照組、中藥組、西藥組分別為6.83%、11.24%、13.48%，復(fù)方組早期細(xì)胞凋亡率最高，為23.94%。 
   
    8 TUNEL法檢測NCI-H446細(xì)胞凋亡 C組藥物作用48h后，對照組僅偶見棕褐色晚期凋亡細(xì)胞，占（0.43±0.15）%。加藥組凋亡率分別為（29.67±3.79）%，（44.00±4.00）%和（57.33±6.02）%，與對照組比較差異均有顯著性（P<00.05）。 
  
    9 NCI-H446蛋白表達(dá)水平 C組藥物作用48h后，NCI-H446細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，DMSo對照組Bcl-2蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞占95.19%，中藥組為85.76%，西藥組為85.36%，復(fù)方組最低為57.27%。 
  
    志苓膠囊可以有效抑制人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，細(xì)胞線粒體跨膜電位水平降低，Caspase.3活性增強(qiáng)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)可能參與了該過程。

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