志苓膠囊可以有效抑制人小細胞肺癌NCI-H446細胞增殖

   志苓膠囊（ZLJN）藥效學試驗表明，該藥對小鼠宮頸癌U14、Lewis肺癌抑制率均在50％以上。本研究進一步觀察志苓膠囊在體外對人小細胞肺癌細胞系NCI-H446增殖及誘導凋亡影響，旨在探討其作用機制，為志苓膠囊臨床應用提供依據。

    肺癌是威脅人類生命的常見病，其中小細胞肺癌約占肺癌總發病率的25％，兩年生存率僅5％。志苓膠囊（ZLJN）藥效學試驗表明，該藥對小鼠宮頸癌U14、Lewis肺癌抑制率均在50％以上。本研究進一步觀察志苓膠囊在體外對人小細胞肺癌細胞系NCI-H446增殖及誘導凋亡影響，旨在探討其作用機制，為志苓膠囊臨床應用提供依據。
  
材料和方法 
    1 藥物 志苓膠囊是由16味中藥和5種西藥組成，即黃芪、女貞子、黃精、北沙參、麥冬、黨參、白術、茯苓、白毛藤、絞股藍、仙鶴草、遠志、陳皮、山藥、芡實、甘草、吲哚美辛、醋酸地塞米松、螺內酯、法莫替丁、地西泮。每粒0.43g，其中志苓膠囊中藥生藥含量1.86g／粒，西藥含量23.95 mg／粒，由福州市第一醫院、福州志苓醫藥研究所提供。按照每粒膠囊的純中藥和西藥含量比例，分別用二甲基亞砜（DMSo）溶解后，配制成不同濃度母液，4℃保存備用。 
   
    2 試劑及儀器 試劑及試劑盒：二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）；RPMI 1640（Gibco-BRL）；MTT（Sigma）；RNaseA （Amresco）；蛋白酶K（Am-resco）；Bcl-2單克隆抗體（Ancel1）；MitoCaptureTM線粒體凋亡檢測試劑盒（Biovision）；CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase-3 Staining Kit（Biovision）；Cell Cycle Test Plus DNA Reagent Kit（Beckton Dickinson）；AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒（Beckton Dickin-son）；DeadEndTM Colorimetric TUNEL System 試劑盒（Promega）。儀器：酶標儀（STAT FAx）；流式細胞儀（BD FACScan）；凝膠圖像分析儀（BIO-RAD）。 
  
    3 細胞及培養體系 選擇Bcl-2高表達的人小細胞肺癌細胞株NCI-H446（引自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫）作為研究對象，置于含10％胎牛血清的RPMI 1640培養液中，37℃、飽和濕度、5％CO2條件下傳代培養。用含0.25％的胰酶和0.03％ 的EDTA 消化液消化貼壁細胞。收集處于70％～80％融合，處于對數生長期的細胞進行實驗。 
   
    4 藥物分組 藥物按其在培養體系體積百分比濃度分為3組，依次為A組：0.1％DMSO組、0.4％中藥組、0.1％ 西藥組以及后兩者組成的復方組；B組：0.2％DMSO組、0.8％ 中藥組、0.2％ 西藥組以及后兩者組成的復方組；C組：0.4％DMSO組、1.6％中藥組、0.4％西藥組以及后兩者組成的復方組，以上A、B、C組用于MTT法檢測細胞存活率和集落形成試驗，再選擇其中最佳濃度組進行其他實驗。 

    5 實驗方法 
    5.1 MTT法檢測細胞增殖 NCI-H446初濃度為1.0×10^5/mL，按以上分組接種于96孔培養板。24h后加藥，每組重復3個平行孔，每孔100uL。用藥48h后，每孔加5mg/mL MTT 10uL，繼續培養4h后，小心吸去上清，每：fLeD 100uL DMSO，在酶標儀上充分震蕩混勻，雙波長492 nm和630 nm 比色。細胞存活率=（實驗組OD值／對照組OD值）×100％。 
     
    5.2 集落形成試驗 調整細胞初濃度為1.33×10^2/mL，按以上分組接種于6孔板，每組重復3個平行孔，每孔1.5mL（約接種200個細胞），常規培養24h后加藥，繼續培養14天后顯微鏡下計算細胞數大于40個的細胞團為一個集落，對照組集落形成率大于40％者實驗有效。集落形成率=（各組集落數/200）×100％ 
   
    5.3 線粒體跨膜電位改變檢測 取對數生長期的細胞，消化后調整細胞濃度為1.0×10^5/mL，接種于培養瓶，24 h后加藥，收集藥物作用24 h后的細胞，按照線粒體凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。 
   
    5.4 Caspase-3活性檢測 藥物處理細胞24 h后，按300uL細胞懸液加1uL FITC-DEvD-FMK，37℃，5％co2孵育30～60min。用Wash Buffer重懸細胞2次后加300uL Wash Buffer，混勻，置于冰上，流式細胞儀分析Caspase-3活性變化。 
   
    5.5 DNA片段化檢測 藥物作用于NCI-H44648h后，約在5.0×10^5細胞中加20uL細胞裂解液[20 mmol／L EDTA，100 mmol／L Tris，0.8％（W／V）SDS]，混勻，加500 U／mL RNaseA 10uL，置37℃ 水浴30～120 min，再加入20 mg／mL蛋白酶K 10uL,50℃水浴過夜。2.0％瓊脂糖凝膠電泳，35V，3h，凝膠圖像分析儀上分析結果。 
    
    5.6 DNA倍體分析 藥物作用細胞48h后，按照說明書步驟操作。用Buffer Solution重懸細胞3次，調整細胞濃度為1.0×10^6/mL，依次加SolutionA、B，分別孵育10 min，最后加Solution C，混勻，冰上孵育10 min，流式細胞儀檢測結果。 
   
    5.7 Annexinv-FITC檢測 藥物作用6 h后，用1×binding buffer調整細胞濃度為1.0×10/mL，吸取100uL加入5uL AnnexinV-FITC和5uL PI試劑，室溫放置暗處15 min，再加入400uL 1×bindingbuffer，1h內流式細胞儀分析結果。 
   
    5.8 TdT 酶介導的原位缺口末端標記法（TUNEL）檢測 收集各藥物組作用48h后的細胞，涂片，干燥后用4％低聚甲醛固定，參照文獻進行操作，顯色后鏡下觀察，細胞核染成棕褐色者為凋亡細胞，計數1000個細胞，計算凋亡率。 
   
    5.9 Bcl-2蛋白表達檢測 藥物作用于NCI-H446 48h后，消化細胞，細胞數應在5.0×10^5左右。PBS（pH 7.4）洗滌2次后，2％中性甲醛室溫固定30min，0.3%皂素滲透5min，棄上清。加1:50稀釋的鼠抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體，冰上孵育45min，PBS洗滌后，流式細胞儀檢測細胞Bcl-2蛋白表達陽性率。 
   
    6 統計學方法 采用SPSS12.0軟件進行統計學處理。單因素方差分析比較各組間差異。
  
結果 
    1 各組對NCI-H446細胞增殖比較 不同濃度的中藥組、西藥組和復方組與NCI-H446共培養48h，加藥組吸光度值與對照組比較差異均有顯著性（P<0.005），細胞生長明顯受到抑制，除中藥組外，這一抑制作用隨西藥組和復方組濃度的升高而增強，C組復方藥物（志苓膠囊）作用后細胞存活率僅40.5%，幾乎未見活細胞。 
   
    2 各組對NCI-H446細胞集落形成比較 志苓膠囊可顯著降低NCI-H446細胞集落形成率（48.17±1.76）%，A組中藥、西藥、復方組集落形成率分別為（46.33±1.04）%、（4.67±0.76）%和（4.50±0.50）%，B組分別為（8.17±0.76）%、（2.83±0.29）￥和（0.86±0.29）%，與對照組比較均有顯著性（P<0.05）。C組（志苓膠囊）均為見有集落形成。  
  
    3 各組線粒體跨膜電位比較 C組藥物作用24h后，對照組線粒體跨膜電位下降的細胞數很少，占0.04%，中藥組、西藥組分別為1.63%、7.54%，復方志苓膠囊組線粒體跨膜電位下降的細胞數明顯增多，占22.06%。 
  
    4 Caspase-3活性檢測 C組藥物作用24h后，DMSO對照組Caspase-3活性增高細胞數較低，占16.51%，中藥組和復方組細胞Caspase-3活性依次增高，分別為26.88%，42.96%和78.52%。 
  
    5 DNA片段化分析 C組藥物與細胞共培養48h后，DNA片段化分析結果顯示，西藥組和復方組處理的細胞有凋亡特征性DNA改變，即形成典型的DNA降解梯狀帶，其中復方志苓膠囊組誘導DNA梯狀帶形成的作用更加明顯，中藥組則較弱。 
  
    6 DNA倍體分析 C組藥物作用NCI-H446 48h后，各組均檢測到明顯的亞二倍體G1峰（凋亡峰），中藥、西藥及復方組凋亡率分別為37.67%，42.37%及55.84%。 
   
    7 AnnexinV-FITC檢測細胞凋亡 C組藥物作用6h即可檢測到早期凋亡細胞，對照組、中藥組、西藥組分別為6.83%、11.24%、13.48%，復方組早期細胞凋亡率最高，為23.94%。 
   
    8 TUNEL法檢測NCI-H446細胞凋亡 C組藥物作用48h后，對照組僅偶見棕褐色晚期凋亡細胞，占（0.43±0.15）%。加藥組凋亡率分別為（29.67±3.79）%，（44.00±4.00）%和（57.33±6.02）%，與對照組比較差異均有顯著性（P<00.05）。 
  
    9 NCI-H446蛋白表達水平 C組藥物作用48h后，NCI-H446細胞Bcl-2蛋白表達水平降低，DMSo對照組Bcl-2蛋白表達陽性細胞占95.19%，中藥組為85.76%，西藥組為85.36%，復方組最低為57.27%。 
  
    志苓膠囊可以有效抑制人小細胞肺癌NCI-H446細胞增殖、誘導其凋亡，細胞線粒體跨膜電位水平降低，Caspase.3活性增強和Bcl-2表達下調可能參與了該過程。

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