ZD1839（Iressa）的基礎研究

在很多人類腫瘤中都存在著表皮生長因子受體（EGFR）和c-erbB2的過表達，研究表明，它們與腫瘤的侵略行為和患者的不良預后有關。EGFR酪氨酸激酶家族起到把細胞外信號轉導到細胞內的作用，增加了腫瘤細胞的增殖，阻止凋亡，增強了其活性、粘附性和侵襲性，其中最重要的是由原癌基因c-erbB-1/HER-1/EGFR和c-erbB-2/her2/neu編碼的EGFR[1],針對EGFR和它的信號轉導的靶向治療能抑制腫瘤細胞的增殖、血管生成和DNA損傷修復。ZD 1839是一種高特異性的EGF受體酪氨酸激酶抑制劑，阻斷信號轉導的第一步，抑制了EGFR磷酸化作用，而有抑制腫瘤細胞增殖的作用[2],與放療和化療聯合應用有協同作用。

　　1 表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的作用機理

　　1.1 EGFR的結構與功能 EGFR是一個分子量為17kDa的跨膜糖蛋白，有配體依賴性的酪氨酸激酶活性，除造血干細胞外，存在于大多數細胞中，在多種腫瘤中都有過表達，如結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等，其中NSCLC的鱗狀細胞癌表達率最高為57%~92%[3].EGFR由3個主要區域組成：一個N端細胞外區域，一個疏水的跨膜區和一個C端細胞內區域，細胞內包括酪氨酸區域。細胞外區域是多種多肽生長因子的配體結合點，其中最重要的是表皮生長因子（EGF）和轉移生長因子α（TGFα）[4].細胞外配體結合區與EGF和TGFα結合后，發生受體二聚合，導致細胞內酪氨酸激酶區域被激活，與一個ATP分子結合，受體自身磷酸化和其他受體單體的脫磷酸化。自體磷酸化把磷酸鹽并入C-末端殘基的酪氨酸中，使其成為一些包括信號傳導體（如p85,Grb2/Sos,PLCγ1等）的Src同源體2（SH2），它的作用是把增殖和生存信號傳導到受體的下游信號傳導途徑中[5].在配體誘導的激活后，EGFR能連接很多參與信號轉導瀑布反應的細胞內蛋白質，包括PLCγ、PI3K、小G蛋白、p21 Ras、GAP和Src家族激酶[6,7],通過不同的受體類型和磷酸化結合的位點，使不同的信號蛋白被激活。這個過程使不同的細胞外信號被傳導到細胞核中。EGFR的酪氨酸激酶活性代表了它的有效結構，并且是信號傳導的基礎，細胞能通過生長因子自體分泌方式發生自身惡變，而為了獲得惡性轉變，需要活性配體的存在和EGFR的高水平表達[8].除了促增殖外，活化的EGFR對腫瘤發展起重要作用的生物學反應還包括：對細胞運動性的影響、細胞粘附、浸潤、細胞生存和血管生成[9].

　　1.2 抗腫瘤治療的新靶向 由于EGFR酪氨酸激酶在腫瘤細胞中的生物學活性，因此它已經成為抗腫瘤治療的新靶向。酪氨酸激酶磷酸化抑制劑作用在細胞內受體區域，通常被稱為TKIs,大多數是完全占據ATP結合位點，因而對EGFR酪氨酸激酶有很好的選擇性。4-苯胺奎哪唑啉是一種與ATP位點結合的有效和選擇性的抑制劑。這類藥物的結構-活性關系清楚定義了其結合方式，奎唑啉環與腺嘌呤結合，苯胺環與鄰近的單一的親脂區結合。一個單獨的鄰近奎唑啉結合位點的半胱氨酸（Cys-773）導致了不可逆的抑制作用[10].其中的代表為口服藥ZD1839">ZD1839（商品名為Iressa）。ZD1839是一種口服的有活性、選擇性和可逆性的表皮生長因子受體（EGRF）酪氨酸激酶抑制劑，它阻斷了在腫瘤細胞增殖和生存中包含的信號傳導途徑。

　　1.3 ZD1839的藥物代謝動力學 ZD1839是有效的EGFR-TKI（IC（50） = 0.033 micro M），口服給藥，一天一次，對腫瘤生長的抑制呈劑量依賴形式，并且腫瘤異種移植物EGFR的表達水平并不影響對ZD1839的敏感性[11].健康志愿者（28名）的藥物代謝動力學的研究結果顯示單一口服ZD1839后，血漿藥物濃度峰值（Cmax）出現在3~7小時，Cmax隨后成雙向下降，半衰期介于27和41小時之間，劑量范圍在10mg~100mg之間，Cmax及AUC24h（0到24小時曲線下面積）和劑量之間呈線性上升關系[12].

　　2 人類腫瘤細胞系和動物模型中的研究

　　通過人類腫瘤細胞系和無胸腺裸鼠人類腫瘤異種移植物模型對ZD1839的研究可以證實其具有抗增殖、抗血管生成和增加凋亡的作用。Ciardiello等[13]評估了ZD1839在共同表達TGFα和EGFR的人類結腸（GEO,SW480和CaCo2）、乳腺（ZR-75-1,MCF-7 ADR）、卵巢（OVCAR-3）和胃（KATO III 和N87）的癌細胞系中的抗血管生成和抗腫瘤作用，GEO異種移植的免疫缺陷鼠，在ZD1839治療后，用免疫組化分析GEO異種移植物顯示了腫瘤細胞中TGFα、bFGF和VEGF的表達下降呈明顯的劑量依賴性，由微血管計數測定的抗新血管生成作用亦有劑量依賴性。英國一個試驗組[14]在對原位導管癌（Ductal carcinoma in situ,DCIS）的異種移植物模型的研究中發現，口服ZD1839（100~200 mg/kg,共14 天）使上皮細胞增殖降低了56%.Anderson NG等[15]觀察到在體外，EGFR過表達的A431和MDA-MB-231乳腺癌細胞系的增殖在給予ZD1839最大有效劑量的一半時就有50%~70%被抑制，抑制了20%~80%EGFR（+）erbB2過表達的腫瘤細胞（SKBr3、SKOV3、BT474）的增殖， ZD1839抑制了無胸腺裸鼠異種移植MDA-MB-231和SKOV3腫瘤的生長，分別為71%和32%.

　　2.1 ZD1839與細胞毒藥物聯合應用的研究 ZD1839與多種細胞毒藥物化療聯合應用具有協同的抗腫瘤活性，這種抑制作用不僅見于進展期轉移的腫瘤，還見于早期病灶，如人類乳腺導管原位癌。Magne等[16]在CA133細胞系（一種高表達EGFR的人類頭頸部癌細胞系）中先加入ZD1839孵育48小時，再加入順鉑和5-Fu孵育48小時。結果發現ZD1839單藥誘導細胞聚集于G0/G1期，在24小時p21、p27 和Bax表達增高，Bcl2表達和Akt磷酸化明顯降低。48小時時DNA-PK降低。ZD1839單獨應用對caspase-3活性沒有影響，但是與順鉑/5-Fu聯合應用時在96小時出現caspase-3的明顯增高。

　　實驗證實在GEO異種移植物模型中，細胞毒藥物PTX聯合應用ZD1839抗癌活性增加[13].觀察到所有聯合應用ZD1839和PTX治療的小鼠腫瘤全部都有縮小，并且有對TGFα、VEGF和 bFGF 表達的抑制作用明顯加強，很少伴有或不伴有微小血管形成。并且16只GEO異種移植鼠中有6只在聯合應用ZD1839和PTX治療后最終均未出現GEO腫瘤組織學證據。這些結果說明ZD1839的抗腫瘤效果伴隨有對自分泌和旁分泌生長因子TGFα、VEGF和 bFGF的抑制，而這些生長因子維持促進了局部組織的生長和新血管的生成。意大利一個研究組[17]對表達EGFR的人類卵巢癌（OVCAR-3）、乳腺癌（ZR-75-1,MCF-10A ras）和結腸癌（GEO）細胞系給予ZD1839聯合細胞毒藥物（順鉑、卡鉑、草酸鉑、紫杉醇、多西紫杉醇、表阿霉素、依托泊甙、拓撲替康和raltitrexed）進行觀察，發現ZD1839聯合任一種化療藥均有協同抑制細胞生長的作用。同時對GEO異種移植的裸鼠，用2.5mgZD1839聯合紫杉醇、拓撲替康和raltitrexed治療，在治療的第4周末，和未治療或單藥治療組比較，對腫瘤的生長有明顯的抑制作用（P=0.01）。美國的一個腫瘤中心[18]研究了對小細胞肺癌（LX-1）、非小細胞肺癌（A549,SK-LC-16）、前列腺癌（PC-3,TSU-PR1）的異種移植物聯合應用ZD1839和鉑類化療藥、紫杉醇、阿霉素和edatrexade治療，證實ZD1839能提高這些細胞毒藥物的抗腫瘤作用，并且ZD1839抗腫瘤活性的提高并不要求這些腫瘤EGFR水平的高表達，提示對沒有EGFR高水平表達的腫瘤，應用ZD1839聯合細胞毒藥物有很大的臨床潛力。

　　2.2 ZD1839與放療聯合應用的研究 EGFR的表達與腫瘤的放療抵抗相關。最近證實EGFR信號傳導在體外能增加放療后細胞的增殖[13],并有人認為腫瘤細胞放療后的修復部分是由于放療后EGFR信號激活所致[19].應用ZD1839可以抑制放療后腫瘤的生長，提高放療敏感性，增加治療反應。在人類頭頸部鱗狀細胞癌的體外和移植物模型中應用ZD1839與放療聯合治療[20],證實ZD1839明顯提高了放療反應，腫瘤抑制作用增強并且延緩了腫瘤的再生長和復發。Wlilliams等[21]在體外將LoVo細胞系（人類結腸癌細胞系）與ZD1839（0.5 microM）孵育1~5天后，分割放療（2 Gyday（-1）， days1-3）的抗增殖效應明顯提高 （P=0.002）。對裸鼠LoVo人類結腸癌異種移植物模型研究了單劑量放療（5Gy）及分割放療（2Gy×5次）聯合應用ZD1839對腫瘤的療效，結果發現不論是單劑量放療還是分割放療，聯合ZD1839,對腫瘤的生長抑制作用均增強（P≤0.001），而以分割形式放療ZD1839的放療增敏作用更明顯，可能是由于放療分割間期中ZD1839對再增殖細胞的抗增殖效應。

　　Shintani S等[22]對5個頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系（HSC2, HSC3, HSC4, SCC25 and Ca9-22）測定了EGFR表達水平與放療敏感性的關系，結果發現這些HNSCC細胞系的放療敏感性差異很大，并且EGFR的表達也不同，EGFR 表達水平（EGFR numbers/cell）與腫瘤對放療抵抗增加有關（f[x]= 4.54 X, R2 = 0.715;f[x]: EGFR numbers/cell, X: radiosensitivity; D10）。1.0 microM ZD1839 聯合放療（0~10 Gy）時，HNSCC細胞系的生長抑制作用增強，ZD1839可以改善腫瘤細胞對放療的反應。Magne N 等[23]對6個頭頸部細胞系研究了放療聯合ZD1839治療的細胞毒效應，認為在放療前給予ZD1839可以獲得最好的效果（P=0.002）。

　　Bianco 等[24]在ZD1839聯合放療在人類結腸癌（GEO）、卵巢癌（OVCAR-3）、非小細胞肺癌（A549和Calu-6）和乳腺癌（MCF-7 ADR）細胞系中都觀察到了劑量依賴性生長抑制。電離輻射后給予ZD1839,觀察到有抗增殖和促凋亡效應，并伴有抗凋亡蛋白bcl-xL和bcl-2表達和Akt蛋白的磷酸化形式的抑制。GEO異種移植物接受RT也為劑量依賴性生長抑制，這種抑制作用在治療終止后可以逆轉。RT聯合ZD1839后有長期的GEO腫瘤生長抑制。聯合治療組小鼠的生存期同對照組相比（P < 0.001），同RT治療組相比（P < 0.001）， 或同ZD1839治療組相比（P < 0.001）均明顯延長。只有聯合RT和ZD1839治療組的小鼠生存達10周，并有10%的小鼠在26周后仍為無病生存。RT與ZD1839聯合應用還伴隨有TGFα、BEFG和bFGF在細胞表達的明顯抑制，這導致GEO腫瘤中的抗血管生成作用。

　　Solomon等[25]發現體外A431（過表達EGFR的人類陰道鱗狀細胞系）放療后應用ZD1839,細胞增殖減少，凋亡增加并且生存期縮短。A431異種移植物無胸腺裸鼠（100 mm3）接受10Gy單次分割或4天每天2.5 Gy分割放療，聯合或不聯合ZD1839（75 mg/kg/d 腹腔給藥10天）時對腫瘤生長的抑制效應。結果顯示不論10Gy（提高比1.5）單次分割或是4天每天2.5 Gy分割放療（提高比4）聯合應用ZD1839后對腫瘤生長的延遲都有更強的效應。ZD1839 減少了腫瘤的血管分布，以及有EGF誘導的VEGF蛋白和mRNA的水平，提示有抑制血管生成的作用。用ZD1839抑制EGFR介導的信號傳導途徑可以加強單分割和多分割放療效果的作用。

　　She Y 等[26]也證實了ZD1839可以明顯提高放療的抗腫瘤活性。人類非小細胞肺癌（A549和SK-LC-16）和乳腺癌（MDA-MB468）和人類間皮瘤（JMN）模型中，當腫瘤達到0.4mm~0.6 mm后，開始予ZD1839的最大耐受劑量（MTD） （150 mg/kg ,每天1次×5天，連續2周），RT（總劑量40 Gy,分割放療4 Gy/天×5 天，連續2周）及ZD1839與RT聯合治療。結果顯示單獨給予ZD1839一種腫瘤生長35%~40%,RT抑制18%~72%,聯合治療抑制50%~99%,并且聯合應用并未增加毒性。

　　3 總結與展望

　　ZD1839是一種口服有活性和選擇性的EGFR-TKI,阻斷信號傳導途徑，抑制腫瘤細胞的增殖和血管生成，它的基礎研究已經證實ZD1839對多種腫瘤有抗腫瘤活性，不論是間斷給藥還是持續給藥，都具有很好的耐受性。在細胞系和異種移植物的研究中已經證實ZD1839同放療或化療聯合應用具有附加的協同作用，可以提供抗腫瘤活性，為進一步聯合治療的臨床試驗提供了理論依據。

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