趙霞　魏于全　彭芝蘭　曹澤毅

 

【摘要】　目的　探討豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和γ-干擾素(γ-IFN )在卵巢癌及其他腫瘤治療中的意義。方法　用PMA+γ-IFN處理的卵巢癌細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1、主要組織相容抗原(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的表達(dá)情況。并采用⁵¹鉻(⁵¹Cr) 4小時(shí)釋放試驗(yàn)及^［3H］胸腺嘧啶滲入法了解B_7-1的表達(dá)對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷活性和對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)情況。結(jié)果　預(yù)先用PMA處理，后用γ-IFN處理的腫瘤細(xì)胞，能誘導(dǎo)B_7-1表達(dá)陽性的伯基特淋巴瘤細(xì)胞株或轉(zhuǎn)染 B_7-1基因的卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞的B_7-1表達(dá)增強(qiáng)，能誘導(dǎo)無 B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株及其他腫瘤細(xì)胞株表達(dá) B_7-1及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，而單獨(dú)用γ-IFN則不能誘導(dǎo) B_7-1表達(dá)。PMA和γ-IFN的這種協(xié)同效應(yīng)能被蛋白激酶抑制劑1-( 5 -磺�；�)異喹啉-2 -甲基哌嗪鹽酸鹽(H7)阻斷。被誘導(dǎo)表達(dá)的 B_7-1能激活CTL的殺傷活性，并能增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖能力。結(jié)論　γ-IFN誘導(dǎo)的B_7-1的表達(dá)可能依賴于PMA預(yù)先激活蛋白激酶C。誘導(dǎo)B_7-1等的表達(dá)對(duì)治療腫瘤有一定的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】　干擾素Ⅱ型　　抗原，CD80　　 T淋巴細(xì)胞　　淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化　　十四酰佛波乙酯

ZHAO Xia, WEI Yuquan, PENG Zhilan, et al.

Department of Obstetrics and Gynecology, Second University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

【Abstract】　Objective　To investigate the therapeutic potential of phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) and interferon-γ(IFN-γ) by induction of expression of adhesion molecule in mucious cystadenocarcinoma of ovary(MCAS) and other tumor cells. Methods　Expression of costimulatory signals(B_7-1), major histocompatibility complex(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ) was analysed with flow cytometry. Cytotoxic T lymphocytes(CTL) killing activity and T cell proliferation induced with expression of B_7-1 were evaluated by 4-h　⁵¹Cr release assay and standard³　HTdR incorporation and scintitation counting. Results　Pretreatment with PMA and then treated with IFN-γ was able to enhance B_7-1 expresssion on the tumor cell lines with the constitutive B_7-1 expression or on B_7-1-transfected tumor cells and to induce B_7-1 expression on MCAS and some tumor cell lines without constitutive B_7-1 expression. However, treament with IFN-γ alone failed to induce B_7-1 expression on the tumor cell lines. The synergistic effect of PMA combined with IFN-γ in the induction of B_7-1 expression can be anatagonised by H7 ［1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methyl-Piperazine dihydrochloride］. In addition, treatment with PMA combined with IFN-γ simultaneously induced or enhanced the expression of MHC class Ⅰ/Ⅱ on these tumor cell lines. The tumor cells treated by PMA combined with IFN-γ were able to induce CTL killing activity and T cell proliferation, which is involved in the expression of B_7-1. Conclusions　The enhancement or induction of B_7-1 expression by IFN-γ may be dependent on the prior activation of protein kinase by PMA and the induced B_7-1 expression on tumor cells may have some therapeutic potential.
【Key words】　Interferon type Ⅱ　　Antigens, CD80　　T-lymphocytes　　Lymphocyte transformationPhorbol myristale acetate

　　 T淋巴細(xì)胞是人體抗腫瘤的主要免疫細(xì)胞，它的活化除需要組織相容抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）遞呈的特異性腫瘤抗原外，還需要共同刺激信號(hào)。免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1在激活T淋巴細(xì)胞免疫過程中是傳遞關(guān)鍵性共同刺激信號(hào)的分子^［1-4］。我們以前的研究也表明，轉(zhuǎn)染 B_7-1基因的腫瘤細(xì)胞能有效地激活 T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)^［5］。
　　本研究觀察了豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)和γ-干擾素(interferon-γ，γ-IFN)誘導(dǎo)B_7-1和其他免疫分子在卵巢癌細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)情況，探討應(yīng)用PMA和γ-IFN在腫瘤免疫效應(yīng)中的意義。

 

一、材料
　　1.腫瘤細(xì)胞株：卵巢粘液性囊腺癌細(xì)胞株(MCAS)、伯基特淋巴瘤細(xì)胞株(Raji)、急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株( Molt-4)，由日本癌學(xué)會(huì)細(xì)胞庫提供。卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株（LM-1）、及轉(zhuǎn)染B_7-1基因的MCAS細(xì)胞株，由日本京都大學(xué)放射線生物研究中心建立。
　　2.其他試劑：γ-IFN購于美國Mallinckrodt公司，蛋白激酶 C (PKC)、PMA 和1-(5-磺酰基)-異喹啉-2-甲基-哌嗪鹽酸鹽( H7 )等購于美國Sigma公司。

二、方法
　　1.T淋巴細(xì)胞的制備：取卵巢癌患者及健康人外周血，用肝素抗凝，集蔗糖梯度離心法分離，得到富含淋巴細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)覆蓋有血清的塑料平板吸附和尼龍網(wǎng)柱去除單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，得到的游離淋巴細(xì)胞，用 30%和 40%的硅化聚乙酰胺吡咯烷酮行非連續(xù)的梯度離心后，即得到靜止T淋巴細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備：預(yù)先用PMA (50 nmol/L)處理24小時(shí)，再加入γ -IFN (100 U/ml)處理 24小時(shí)的卵巢癌細(xì)胞，或未經(jīng)處理的卵巢癌細(xì)胞，經(jīng)絲裂霉素（ 50μg/ml）處理1小時(shí)滅活。將1×10⁵個(gè)滅活后的卵巢癌細(xì)胞與1×10⁶個(gè)T淋巴細(xì)胞加在1 ml含有10% 小牛血清 (FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，接種于24孔平底組織培養(yǎng)板內(nèi)。阻斷實(shí)驗(yàn)用抗B_7-1單抗 ( 5μg/ml)和對(duì)照抗體抗CD7單抗進(jìn)行。培養(yǎng)6天之后，得到擴(kuò)增的 CTL。
　　3.T淋巴細(xì)胞殺傷活性的計(jì)算方法：用標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)⁵¹鉻(⁵¹Cr)釋放試驗(yàn)分析，詳見參考文獻(xiàn)［6-7］。
　　4.T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢測方法：用^［3H］胸腺嘧啶（³HTdR）滲入法測定，詳見參考文獻(xiàn)［6-7］。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)：用美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀檢測B_7-1、MHC-I、MHC-Ⅱ在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　本研究資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。

 

一、PMA+γ-IFN對(duì)表達(dá)B_7-1腫瘤細(xì)胞的作用
　　單獨(dú)用PMA處理表達(dá)B_7-1的Raji細(xì)胞24～48小時(shí)，能稍增強(qiáng)B_7-1的表達(dá)，而單獨(dú)用γ-IFN處理不能增強(qiáng) B_7-1在Raji細(xì)胞上的表達(dá)。但先用PMA (50 nmol/L)處理24小時(shí)，再加入γ-IFN(100U/ml)處理24小時(shí)，能明顯增強(qiáng) B_7-1在Raji細(xì)胞上的表達(dá)，平均熒光強(qiáng)度可增至2倍。用PMA+γ-IFN處理Raji細(xì)胞與單用PMA或單用γ-IFN處理Raji細(xì)胞比較B_7-1的熒光強(qiáng)度，差異均有極顯著性（P<O.01）。這種效應(yīng)與PMA的使用劑量相關(guān)。在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染有 B_7-1基因的MCAS細(xì)胞株B_7-1的表達(dá)時(shí)，也可得到類似的結(jié)果。

二、PMA+γ-IFN對(duì)未表達(dá)B_7-1腫瘤細(xì)胞的作用
　　MCAS、LM-1和Molt-4細(xì)胞株經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測未發(fā)現(xiàn)B_7-1的表達(dá)。用PMA (1～200 nmol/L)單獨(dú)處理這些細(xì)胞24～48小時(shí)，可不同程度誘導(dǎo)出B_7-1的表達(dá)。而先用PMA (1～200 nmol/L)處理24小時(shí)，后用γ-IFN(100U/ml)處理24小時(shí)時(shí)，這些細(xì)胞表達(dá)B_7-1的強(qiáng)度進(jìn)一步增加。這種效應(yīng)與PMA的使用劑量相關(guān)。用PMA+γ-IFN或單用PMA處理各組腫瘤細(xì)胞與未處理組比較B_7-1的熒光強(qiáng)度，差異均有極顯著性(P<0.01)。見圖1。

 

圖1　PMA+γ-IFN誘導(dǎo)MCAS細(xì)胞B_7-1的表達(dá)

 

三、H7對(duì)PMA+γ-IFN的作用
　　H7不影響固有的B_7-1在Raji細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有B_7-1的MCAS細(xì)胞上的表達(dá)，但抑制PMA +γ-IFN誘導(dǎo)的B_7-1的表達(dá)。

四、PMA+γ-IFN對(duì)MHC-I、MHC-Ⅱ的誘導(dǎo)作用
　　MCAS、轉(zhuǎn)染B_7-1的MCAS和LM-1不表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，Raji和Molt-4不同程度地表達(dá)MHC-Ⅰ，僅Raji細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ。PMA +γ-IFN能誘導(dǎo)上述幾種表達(dá)MHC-Ⅰ的細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)不表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ。

五、PMA+γ-IFN誘導(dǎo)B_7-1表達(dá)的免疫效應(yīng)
　　MCAS、LM-1等用PMA+γ-IFN處理后，能誘導(dǎo)異體CTL對(duì)其殺傷活性增強(qiáng)，而對(duì)未用PMA+γ-IFN處理的卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性也增強(qiáng)，并刺激異體CTL的增殖。這些效應(yīng)能被B_7-1單克隆抗體抑制，表明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞B_7-1的表達(dá)能激發(fā)有效的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。從新鮮卵巢癌組織分離的癌細(xì)胞經(jīng)PMA+γ-IFN處理，同樣能誘導(dǎo) B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達(dá)，能增強(qiáng)患者自身的CTL殺傷活性及細(xì)胞增殖。

 

討論
　　抗腫瘤免疫反應(yīng)主要依賴于T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，T淋巴細(xì)胞的激活依賴于MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ遞呈的特異性腫瘤抗原刺激和B_7-1等提供的共刺激信號(hào)。已有研究報(bào)道，無MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)的腫瘤細(xì)胞即使轉(zhuǎn)染B_7-1也不能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞活化^［8-9］。另一方面，如僅有腫瘤抗原刺激而無共刺激分子B_7-1刺激時(shí)，T淋巴細(xì)胞不但不能被激活，反而使其喪失功能。表明在腫瘤細(xì)胞上的B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ共同表達(dá)才能有效地激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。但MHC-Ⅰ在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞常常是低表達(dá)，而MHC-Ⅱ幾乎不表達(dá)，除了B細(xì)胞淋巴瘤外，絕大部分腫瘤細(xì)胞都沒有B_7-1的表達(dá)，因此，機(jī)體的抗腫瘤免疫力低下。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)，先用PMA處理MCAS等細(xì)胞，后用γ-IFN能誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，這些有B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ同時(shí)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞能激活外周血淋巴細(xì)胞，活化的CTL不僅對(duì)這些表達(dá)B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的腫瘤細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)，也對(duì)未用PMA+γ-IFN處理的腫瘤細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng)，同時(shí)增殖能力也成倍增加。
　　為了探討PMA+γ-IFN誘導(dǎo)B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)的機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)用蛋白激酶抑制劑H7能阻斷PMA的增強(qiáng)γ-IFN誘導(dǎo)B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)的效應(yīng)，提示γ-IFN的這種誘導(dǎo)B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)的效應(yīng)，可能依賴于PMA預(yù)先激活PKC。
　　綜上所述，本研究提示PMA與γ-IFN的合用可能對(duì)卵巢癌或其他惡性腫瘤有一定的治療價(jià)值。

本課題受國家自然科研基金資助(基金編號(hào)：39680030及39740006)及國家杰出青年科研基金部分資助(基金編號(hào)：39725031)

 

作者單位：趙霞　彭芝蘭　曹澤毅　華西醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科　成都　610041
魏于全　附屬第一醫(yī)院腫瘤生物治療中心

 

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