趙霞　魏于全　彭芝蘭　曹澤毅

 

【摘要】　目的　探討豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和γ-干擾素(γ-IFN )在卵巢癌及其他腫瘤治療中的意義。方法　用PMA+γ-IFN處理的卵巢癌細胞及其他腫瘤細胞用流式細胞儀檢測免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1、主要組織相容抗原(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的表達情況。并采用⁵¹鉻(⁵¹Cr) 4小時釋放試驗及^［3H］胸腺嘧啶滲入法了解B_7-1的表達對細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷活性和對T淋巴細胞增殖的誘導情況。結果　預先用PMA處理，后用γ-IFN處理的腫瘤細胞，能誘導B_7-1表達陽性的伯基特淋巴瘤細胞株或轉染 B_7-1基因的卵巢粘液性囊腺癌細胞的B_7-1表達增強，能誘導無 B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達的卵巢癌細胞株及其他腫瘤細胞株表達 B_7-1及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，而單獨用γ-IFN則不能誘導 B_7-1表達。PMA和γ-IFN的這種協同效應能被蛋白激酶抑制劑1-( 5 -磺酰基)異喹啉-2 -甲基哌嗪鹽酸鹽(H7)阻斷。被誘導表達的 B_7-1能激活CTL的殺傷活性，并能增強T淋巴細胞的增殖能力。結論　γ-IFN誘導的B_7-1的表達可能依賴于PMA預先激活蛋白激酶C。誘導B_7-1等的表達對治療腫瘤有一定的價值。

【關鍵詞】　干擾素Ⅱ型　　抗原，CD80　　 T淋巴細胞　　淋巴細胞轉化　　十四酰佛波乙酯

ZHAO Xia, WEI Yuquan, PENG Zhilan, et al.

Department of Obstetrics and Gynecology, Second University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041

【Abstract】　Objective　To investigate the therapeutic potential of phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) and interferon-γ(IFN-γ) by induction of expression of adhesion molecule in mucious cystadenocarcinoma of ovary(MCAS) and other tumor cells. Methods　Expression of costimulatory signals(B_7-1), major histocompatibility complex(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ) was analysed with flow cytometry. Cytotoxic T lymphocytes(CTL) killing activity and T cell proliferation induced with expression of B_7-1 were evaluated by 4-h　⁵¹Cr release assay and standard³　HTdR incorporation and scintitation counting. Results　Pretreatment with PMA and then treated with IFN-γ was able to enhance B_7-1 expresssion on the tumor cell lines with the constitutive B_7-1 expression or on B_7-1-transfected tumor cells and to induce B_7-1 expression on MCAS and some tumor cell lines without constitutive B_7-1 expression. However, treament with IFN-γ alone failed to induce B_7-1 expression on the tumor cell lines. The synergistic effect of PMA combined with IFN-γ in the induction of B_7-1 expression can be anatagonised by H7 ［1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methyl-Piperazine dihydrochloride］. In addition, treatment with PMA combined with IFN-γ simultaneously induced or enhanced the expression of MHC class Ⅰ/Ⅱ on these tumor cell lines. The tumor cells treated by PMA combined with IFN-γ were able to induce CTL killing activity and T cell proliferation, which is involved in the expression of B_7-1. Conclusions　The enhancement or induction of B_7-1 expression by IFN-γ may be dependent on the prior activation of protein kinase by PMA and the induced B_7-1 expression on tumor cells may have some therapeutic potential.
【Key words】　Interferon type Ⅱ　　Antigens, CD80　　T-lymphocytes　　Lymphocyte transformationPhorbol myristale acetate

　　 T淋巴細胞是人體抗腫瘤的主要免疫細胞，它的活化除需要組織相容抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）遞呈的特異性腫瘤抗原外，還需要共同刺激信號。免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B_7-1在激活T淋巴細胞免疫過程中是傳遞關鍵性共同刺激信號的分子^［1-4］。我們以前的研究也表明，轉染 B_7-1基因的腫瘤細胞能有效地激活 T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應^［5］。
　　本研究觀察了豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)和γ-干擾素(interferon-γ，γ-IFN)誘導B_7-1和其他免疫分子在卵巢癌細胞及其他腫瘤細胞上的表達情況，探討應用PMA和γ-IFN在腫瘤免疫效應中的意義。

 

一、材料
　　1.腫瘤細胞株：卵巢粘液性囊腺癌細胞株(MCAS)、伯基特淋巴瘤細胞株(Raji)、急性T淋巴細胞白血病細胞株( Molt-4)，由日本癌學會細胞庫提供。卵巢漿液性囊腺癌細胞株（LM-1）、及轉染B_7-1基因的MCAS細胞株，由日本京都大學放射線生物研究中心建立。
　　2.其他試劑：γ-IFN購于美國Mallinckrodt公司，蛋白激酶 C (PKC)、PMA 和1-(5-磺酰基)-異喹啉-2-甲基-哌嗪鹽酸鹽( H7 )等購于美國Sigma公司。

二、方法
　　1.T淋巴細胞的制備：取卵巢癌患者及健康人外周血，用肝素抗凝，集蔗糖梯度離心法分離，得到富含淋巴細胞的單個核細胞，經覆蓋有血清的塑料平板吸附和尼龍網柱去除單核細胞和B淋巴細胞，得到的游離淋巴細胞，用 30%和 40%的硅化聚乙酰胺吡咯烷酮行非連續的梯度離心后，即得到靜止T淋巴細胞。
　　2.細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的制備：預先用PMA (50 nmol/L)處理24小時，再加入γ -IFN (100 U/ml)處理 24小時的卵巢癌細胞，或未經處理的卵巢癌細胞，經絲裂霉素（ 50μg/ml）處理1小時滅活。將1×10⁵個滅活后的卵巢癌細胞與1×10⁶個T淋巴細胞加在1 ml含有10% 小牛血清 (FCS)的RPMI-1640培養液中，接種于24孔平底組織培養板內。阻斷實驗用抗B_7-1單抗 ( 5μg/ml)和對照抗體抗CD7單抗進行。培養6天之后，得到擴增的 CTL。
　　3.T淋巴細胞殺傷活性的計算方法：用標準4小時⁵¹鉻(⁵¹Cr)釋放試驗分析，詳見參考文獻［6-7］。
　　4.T淋巴細胞增殖反應的檢測方法：用^［3H］胸腺嘧啶（³HTdR）滲入法測定，詳見參考文獻［6-7］。
　　5.流式細胞術：用美國Becton Dickinson公司生產的流式細胞儀檢測B_7-1、MHC-I、MHC-Ⅱ在腫瘤細胞上的表達。

三、統計學方法
　　本研究資料的統計學分析采用t檢驗。

 

一、PMA+γ-IFN對表達B_7-1腫瘤細胞的作用
　　單獨用PMA處理表達B_7-1的Raji細胞24～48小時，能稍增強B_7-1的表達，而單獨用γ-IFN處理不能增強 B_7-1在Raji細胞上的表達。但先用PMA (50 nmol/L)處理24小時，再加入γ-IFN(100U/ml)處理24小時，能明顯增強 B_7-1在Raji細胞上的表達，平均熒光強度可增至2倍。用PMA+γ-IFN處理Raji細胞與單用PMA或單用γ-IFN處理Raji細胞比較B_7-1的熒光強度，差異均有極顯著性（P<O.01）。這種效應與PMA的使用劑量相關。在誘導轉染有 B_7-1基因的MCAS細胞株B_7-1的表達時，也可得到類似的結果。

二、PMA+γ-IFN對未表達B_7-1腫瘤細胞的作用
　　MCAS、LM-1和Molt-4細胞株經流式細胞儀檢測未發現B_7-1的表達。用PMA (1～200 nmol/L)單獨處理這些細胞24～48小時，可不同程度誘導出B_7-1的表達。而先用PMA (1～200 nmol/L)處理24小時，后用γ-IFN(100U/ml)處理24小時時，這些細胞表達B_7-1的強度進一步增加。這種效應與PMA的使用劑量相關。用PMA+γ-IFN或單用PMA處理各組腫瘤細胞與未處理組比較B_7-1的熒光強度，差異均有極顯著性(P<0.01)。見圖1。

 

圖1　PMA+γ-IFN誘導MCAS細胞B_7-1的表達

 

三、H7對PMA+γ-IFN的作用
　　H7不影響固有的B_7-1在Raji細胞和轉染有B_7-1的MCAS細胞上的表達，但抑制PMA +γ-IFN誘導的B_7-1的表達。

四、PMA+γ-IFN對MHC-I、MHC-Ⅱ的誘導作用
　　MCAS、轉染B_7-1的MCAS和LM-1不表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，Raji和Molt-4不同程度地表達MHC-Ⅰ，僅Raji細胞表達MHC-Ⅱ。PMA +γ-IFN能誘導上述幾種表達MHC-Ⅰ的細胞MHC-Ⅰ表達增強，誘導不表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的細胞表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ。

五、PMA+γ-IFN誘導B_7-1表達的免疫效應
　　MCAS、LM-1等用PMA+γ-IFN處理后，能誘導異體CTL對其殺傷活性增強，而對未用PMA+γ-IFN處理的卵巢癌細胞的殺傷活性也增強，并刺激異體CTL的增殖。這些效應能被B_7-1單克隆抗體抑制，表明誘導腫瘤細胞B_7-1的表達能激發有效的T淋巴細胞介導的免疫反應。從新鮮卵巢癌組織分離的癌細胞經PMA+γ-IFN處理，同樣能誘導 B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表達，能增強患者自身的CTL殺傷活性及細胞增殖。

 

討論
　　抗腫瘤免疫反應主要依賴于T淋巴細胞介導的細胞免疫，T淋巴細胞的激活依賴于MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ遞呈的特異性腫瘤抗原刺激和B_7-1等提供的共刺激信號。已有研究報道，無MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達的腫瘤細胞即使轉染B_7-1也不能誘導T淋巴細胞活化^［8-9］。另一方面，如僅有腫瘤抗原刺激而無共刺激分子B_7-1刺激時，T淋巴細胞不但不能被激活，反而使其喪失功能。表明在腫瘤細胞上的B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ共同表達才能有效地激活T淋巴細胞介導的抗腫瘤免疫反應。但MHC-Ⅰ在大多數腫瘤細胞常常是低表達，而MHC-Ⅱ幾乎不表達，除了B細胞淋巴瘤外，絕大部分腫瘤細胞都沒有B_7-1的表達，因此，機體的抗腫瘤免疫力低下。
　　我們的研究發現，先用PMA處理MCAS等細胞，后用γ-IFN能誘導這些腫瘤細胞同時表達B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，這些有B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ同時表達的腫瘤細胞能激活外周血淋巴細胞，活化的CTL不僅對這些表達B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的腫瘤細胞殺傷活性增強，也對未用PMA+γ-IFN處理的腫瘤細胞的殺傷活性增強，同時增殖能力也成倍增加。
　　為了探討PMA+γ-IFN誘導B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達增強的機制，我們發現用蛋白激酶抑制劑H7能阻斷PMA的增強γ-IFN誘導B_7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達的效應，提示γ-IFN的這種誘導B_7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達增強的效應，可能依賴于PMA預先激活PKC。
　　綜上所述，本研究提示PMA與γ-IFN的合用可能對卵巢癌或其他惡性腫瘤有一定的治療價值。

本課題受國家自然科研基金資助(基金編號：39680030及39740006)及國家杰出青年科研基金部分資助(基金編號：39725031)

 

作者單位：趙霞　彭芝蘭　曹澤毅　華西醫科大學附屬第二醫院婦產科　成都　610041
魏于全　附屬第一醫院腫瘤生物治療中心

 

參考文獻
　1　Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev Immunol, 1993, 11:191-212.
　2　Pulaski BA, Ostrand-Rosenberg S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class Ⅱ and B_7-1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research, 1998, 58:1486-1493.
　3　Chen LP, McGowan P, Ashe S, et al. Tumor immunogenicity detemines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated Tumor Immunity. J Exp Med, 1994, 179: 523-532.
　4　Chen L, Linsley PS, Hellström KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today, 1993, 14:482-486.
　5　趙霞，魏于全.導入B_7-1分子基因NK細胞敏感靶細胞誘導腫瘤免疫反應的研究. 中華醫學遺傳雜志，1998, 15:209-212.
　6　Zhao X, Wei YQ, Kariya Y, et al. Accumulation of gamna/delta T cells in human dysgerminoma and seminoma: roles in autologous tumor killing and granuloma formation. Immunol Invest, 1995, 24:607-618.
　7　Wei YQ, Zhao X, Kariya Y, et al. Induction of autologous tumor killing by heat treament of fresh human tumor cell: involvement of gamma/delta T cells and Heat Shock Protein 70. Cancer Research, 1996, 56:1104-1110.
　8　Vandenberghe P, Delabie J, Boer Md, et al. In situ expression of B7/BB1 on antigen-presenting cells and activating B cells: an immunohistochemical study. Int Immunol, 1993, 5:317-321.
　9　Becker JC, Brabletz T, Czerny C, et al. Tumor escape mechanisms from immunosurveillance: induction of unresponsiveness in a specific MHC-restricted CD4⁺ human T cell clone by the autologous MH class CII⁺ melanoma. Int Imunol, 1993, 5:1501-1508.