臨床研究肉蔻五味(匝迪-5味)丸治療心肌梗死損傷的作用機制

    心肌細胞凋亡是近年國內(nèi)外研究的熱點，在許多心血管疾病如心肌梗塞、心臟猝死等的發(fā)生發(fā)展中，心肌細胞凋亡可能是重要的參與機制之一。近年研究認為ISO可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的發(fā)生，但其機制不明。肉蔻五味丸是具有民族特色的傳統(tǒng)復(fù)方制劑，由廣棗、木香、土木香、篳茇、肉豆蔻組成。本實驗采用大劑量ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死為模型，通過與卡托普利的對照研究，觀察肉蔻五味丸是否具有治療心肌梗死的作用，并從分子水平探討肉蔻五味丸治療心肌梗死損傷的作用機制。
   
1 　材料 
    1.1 動物：雄性SD 大鼠66 只，體重（200±20）g ，由杭州省動物中心提供。合格證號SCXK浙2003-0001。 
    1.2 藥品：鹽酸異丙基腎上腺素注射液（ISO）：上海禾風(fēng)制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H31021344；卡托普利：安徽蕪湖市博英制藥有限公司，批號：H34023645；蒙藥肉蔻五味丸：內(nèi)蒙古烏蘭浩特市中蒙制藥有限公司，批號：Z15021785。 
    1.3 試劑：細胞凋亡檢測試劑盒，編號：MK1020，武漢博士德公司產(chǎn)品。CoCl2•6H2O 試劑，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。 
    1.4 儀器：多導(dǎo)電生理記錄儀ML785 SP9612POWERLAB/ 8SPADI（澳大利亞）； 病理圖象分析系統(tǒng)OLYMPUS CX40LOGENE- I PAS9000；DU640 紫外可見光分光光度計（美國貝克曼公司）。

 
2 　方法 
    2.1 動物分組：將66 只雄性SD大鼠隨機分為6 組，正常組6只，模型組12 只，卡托普利治療組12只，肉蔻五味丸低劑量治療組12只，肉蔻五味丸中劑量治療組12只，肉蔻五味丸高劑量治療組12 只。 

 
    2.2 模型制備及取材：模型組和治療組大鼠皮下注射IS010mg/kg，連續(xù)3 天。并以注射IS0 第3 天后心電圖的改變來判斷模型成立。卡托普利組和肉蔻五味丸組在注射IS0 第3 次后12 小時開始分別給予卡托普利50mg/ kg ，低劑量肉蔻五味丸0.2g/ kg ，中劑量肉蔻五味丸0.5g/ kg ，高劑量肉蔻五味丸1g/ kg 灌胃，模型組與正常組則灌胃等體積的生理鹽水，1天1次，至各實驗終點。各組實驗動物在開始灌胃后3d、7d相應(yīng)時段用3 % 戊巴比妥鈉50mg/ kg 腹腔麻醉后分別處死6只，正常對照組于第7 天全部處死。心臟取血做IMA，心臟標本用4 %甲醛固定24h，做4μm 厚的石蠟連續(xù)切片，分別做HE 和TUNEL 染色。 
 
    2.3 IMA 檢測：根據(jù)Bar-Or等建立的比色測定法測定。將50μl 0.1 % CoCl2•6H2O 水溶液中加入200μl 待測血清，輕輕混勻，放置10min，再加入50μl15 %二巰基蘇糖醇（DTT）水溶液，使其顯色2min，最后加入0.9 % NaCl 溶液10ml 終止反應(yīng)，用紫外可見分光光度計測定其在470nm 處的吸光度ABSU；同時，每一測試樣本均要求做樣本空白（加DTT 改為加蒸餾水），結(jié)果用吸光度單位報告（ABSU）。

    
    2.4 原位細胞凋亡檢測：采用TUNEL法，具體步驟按試劑盒說明操作，陽性判定標準：細胞核被染成棕褐色為陽性結(jié)果。

   
    2.5 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS1310 軟件分析，用均數(shù)±標準差（X ±S）表示，兩組間比較用t 檢驗，多組間比較用單因素方差分析。

  
3 　結(jié)果 
    3.1 　心肌梗死大鼠心臟的病理變化 
    肉眼觀：心肌梗死區(qū)形狀不規(guī)則，梗死灶呈蒼白色，第7 天在梗死灶周邊出現(xiàn)明顯的充血、出血帶。光鏡下可見心肌細胞漿嗜伊紅性增高，心肌纖維不均勻性肥大，胞核增多，增大深染，梗死灶邊緣可見充血帶及中性粒細胞浸潤，正常組大鼠未見異常改變。

  
    3.2 　IMA 檢測
用比色法測定血清中白蛋白與外源性鈷結(jié)合能力的變化，結(jié)果用吸光度單位報告（ABSU），見表1。

    各組大鼠造模后IMA 情況提示：ISO 造成心肌缺血損傷可明顯引起IMA 降低，尤以早期顯著，肉蔻五味丸中、高劑量治療組及卡托組可顯著提高IMA 水平，與模型組比較差異有顯著性（ P< 0.01），與卡托普利治療組比較，肉蔻五味丸高劑量治療組無明顯差異（P >0.05）。 
   
    3.3 　心肌細胞凋亡檢測結(jié)果TUNEL 法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡的情況以細胞核被染成棕褐色為陽性表達，陰性對照片（PBS為一抗）無棕黃色著色。每張切片在光鏡下隨機選取10 個視野，計算在1 000個細胞中的陽性細胞數(shù)。結(jié)果見表2。

    各組大鼠造模后心肌細胞凋亡情況提示：連續(xù)注射異丙基腎上腺素造成大鼠心肌缺血損傷，可明顯引起心肌細胞凋亡，尤以早期顯著，肉蔻五味丸治療組及卡托組心肌細胞凋亡陽性細胞數(shù)明顯減少，與模型組比較，差異有顯著性（P < 0.05），其中尤以肉蔻五味丸高劑量組更為顯著。

  
4 討論 
    大劑量異丙基腎上腺素（i soprenaline，ISO）所造成的大鼠心肌梗死模型，其心電圖演變、心肌代謝改變及組織病理學(xué)的變化均與人類自然發(fā)生的急性心肌梗死非常接近；本實驗中心電圖顯示異常Q 波，ST 段抬高超過0.05mv，與臨床心肌梗死的心電變化相似，提示模型成功建立。

  
    心肌梗死會導(dǎo)致白蛋白的N末端結(jié)構(gòu)發(fā)生一些改變，正是這種結(jié)構(gòu)的改變影響了白蛋白與外源性鈷元素的結(jié)合能力。因此通過檢測血漿中白蛋白與鈷元素的結(jié)合能力，就可以了解因梗死而改變的白蛋白的水平。心肌缺血血清白蛋白與鈷離子的結(jié)合和非梗死相比結(jié)合力下降，本實驗結(jié)果顯示治療組與模型組相比（ P< 0.05）有顯著意義。 

 
    目前雖然對心肌梗死損傷的確切機制還不十分清楚，但已證實，持續(xù)性心肌缺血可以導(dǎo)致組織損傷和細胞死亡，過去認為心肌細胞在梗死損傷中死亡全部是壞死，但近年來大量的研究表明大鼠及人的心肌梗死損傷中有大量的心肌細胞經(jīng)歷了調(diào)亡過程〔2～5〕。本實驗中給藥組動物心肌梗死邊緣區(qū)凋亡現(xiàn)象的觀察顯示藥物治療組的凋亡陽性細胞數(shù)較模型組明顯減少，給藥3 天與7 天時相比，隨著給藥時間的延長，凋亡有所減少，與模型組比較，卡托治療組與肉蔻五味丸高劑量治療組的細胞凋亡陽性數(shù)顯著降低（P < 0.01）。本實驗提示通過抑制和阻斷細胞凋亡的發(fā)生，可能是蒙藥肉蔻五味丸防治冠心病心肌梗死損傷的作用機制之一。

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