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甄麗芳，羅遠(yuǎn)帶，黃福開，胡賢達(dá)，邵杰，劉亞麗，尚穎，杜文兵

( 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州510515; 1 北京藏醫(yī)院，北京100029)

　　摘要 目的:探討七十味珍珠丸對永久性大腦中動脈阻塞( pMCAO) 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。方法: 取SD 大鼠用線栓法制備pMCAO 模型。觀察七十味珍珠丸對pMCAO 大鼠神經(jīng)功能損傷情況( Bederson 評分和Ｒotarod test) 、血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) 及S-100β 蛋白水平的影響。結(jié)果:與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 顯著降低Bederson 評分，延長轉(zhuǎn)棒潛伏期( P ＜ 0． 01) ;與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 、低劑量組( 166mg /kg) 中NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降( P ＜ 0． 01) 。結(jié)論:七十味珍珠丸可有效降低pMCAO 大鼠血清中NSE、S-100β 蛋白水平，改善其神經(jīng)功能缺損，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，效應(yīng)細(xì)胞既在神經(jīng)元，又在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

　　關(guān)鍵詞:七十味珍珠丸; 局灶性腦缺血損傷; 神經(jīng)行為學(xué); 神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) ; S-100β 蛋白

　　缺血性腦卒中是一組以腦組織缺血性損傷和體征為主要臨床表現(xiàn)的急性腦血管病，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點。神經(jīng)細(xì)胞變性壞死是導(dǎo)致缺血性腦卒中患者死亡和嚴(yán)重病殘的基本因素。因此，最大限度地保留健康的神經(jīng)細(xì)胞是治療缺血性腦卒中的重要環(huán)節(jié)。七十味珍珠丸( Ｒannasangpei)是藏醫(yī)最有代表性的名貴珍寶藏成藥之一，具有醒腦開竅、安神、鎮(zhèn)靜，通經(jīng)活絡(luò)，調(diào)和氣血之功效，臨床治療缺血性腦卒中損傷( 中風(fēng)、癱瘓、半身不遂、腦栓塞等) 效果良好。但是關(guān)于七十味珍珠丸神經(jīng)保護(hù)作用的實驗研究報道卻甚少，現(xiàn)通過檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) 和S-100β 蛋白的表達(dá)水平及神經(jīng)功能損傷情況來觀察七十味珍珠丸的神經(jīng)保護(hù)作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗藥物七十味珍珠丸由北京藏醫(yī)院提供，批號:

　　20130109。維腦路通片( 曲克蘆丁片) 由亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號: 20130701。

　　1.2 動物SPF 級SD 大鼠40 只，體重230 ～ 250g，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號: SCXK 粵2013-0020( NO: 44005900000285) 。

　　1.3 試劑大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) ELISA 試劑盒、S-100β 蛋白ELISA 試劑盒均購自廣州拓科達(dá)生物科技有限公司。

　　1.4 儀器Thermo 酶標(biāo)儀、2K-15 低溫離心機(jī)、Panlab 轉(zhuǎn)棒儀等均由南方醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)樓解剖教研室提供。

　　1.5 方法大鼠40 只，隨機(jī)分成5 組，即假手術(shù)組; pMCAO 模型組; 七十味低劑量組( 166mg /kg) ; 七十味高劑量組( 664mg /kg) ; 維腦路通組( 50mg /kg) ，每組各8 只大鼠。每天灌胃給藥1次( 按體表面積法) ，連續(xù)14 天，于造模前1h 給藥1 次，給藥劑量及途徑同前。假手術(shù)組和pMCAO 模型組用蒸餾水灌胃。造模前一個星期，每天上午9: 00 各組老鼠均進(jìn)行轉(zhuǎn)棒練習(xí)，每天1 次，每次5 分鐘。

　　采用改良后的Zea Longa 模型［1］制作。實驗動物以10% 的水合氯醛( 0． 32ml / 100g) 腹腔麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露右側(cè)頸總動脈( CCA) ，沿著頸總動脈快速分離勁外動脈( ECA) 和頸內(nèi)動脈( ICA) 。電凝聯(lián)系ECA 與ICA 之間的動脈。在右ECA 主干的遠(yuǎn)心端1． 5cm 處結(jié)扎，提拉ECA 殘端的結(jié)扎線，用微型血管夾在CCA 分出ECA 處，將ECA 臨時夾閉，在血管夾與ECA 殘端之間結(jié)扎一道縫合線，不打緊。在ECA遠(yuǎn)心端死結(jié)與近心端活結(jié)之間開一小口，用制備好的直徑為0．21mm 線栓沿ECA 插入，扎緊縫合線，綁住線栓，同時松開微型血管夾。當(dāng)線栓頭端進(jìn)到ICA 與ECA 的分叉處。剪斷開口上端的ECA，使線栓掉頭進(jìn)入右ICA，避開翼顎動脈( PPA) ，待線栓標(biāo)記點( 距線栓頂端18mm 處做標(biāo)記) 進(jìn)到分叉內(nèi)，有阻擋感時，扎緊線栓，縫合切口。在插線的過程中要注意手感，當(dāng)遇到阻力時不要用蠻勁插入，當(dāng)線栓彎曲時要更換，手法要輕柔、迅速。假手術(shù)組: 只是不插入線栓，其他步驟與上述步驟相同。

　　1. 5.1 神經(jīng)功能缺損評分［2］ ( Bederson 評分) 各組大鼠于造模24h 后進(jìn)行Bederson 評分。在規(guī)定時間點由三個協(xié)作者盲法評分，最后取平均值。模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)為評分≥l 分。

　　評分標(biāo)準(zhǔn): 0 分: 提尾后( 距地1 米) ，大鼠兩前爪完全伸向地面，無神經(jīng)功能缺損; 1 分: 提尾后( 距地1 米) ，前肢出現(xiàn)任何屈曲成分，不伴其他不正常; 2 分: 拉住尾部，于大鼠肩后施加側(cè)壓，側(cè)推抵抗力下降，伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為; 3 分: 同2 級行為，伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)( 自由活動時向癱瘓側(cè)劃圈) 。

　　1.5.2 神經(jīng)運動功能測評［3］ ( Ｒotarod test) 各組大鼠造模24h 后上午9: 00，調(diào)整轉(zhuǎn)棒速度為10rpm，將大鼠置于直徑7 cm的旋轉(zhuǎn)圓棒上，記錄大鼠被置于棒上至跌落的時間( 潛伏期) ，每只動物重復(fù)測3 次，每次間隔60min，最后取平均值，轉(zhuǎn)棒潛伏期≥3 分鐘者，均記作3 分鐘。測試結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為大鼠從轉(zhuǎn)棒掉下或放棄行走而抓緊轉(zhuǎn)棒旋轉(zhuǎn)滿2 周。測試前每只動物均進(jìn)行兩次適應(yīng)性訓(xùn)練。

　　1.5.3 血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平檢測各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測評后，分別腹主動脈采血4ml，4℃過夜待血液凝固后于3000rpm 離心10min，取血清分裝，-20℃保存。按ELISA 試劑盒說明書測定血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平。

　　2 結(jié)果

　　2.1 各組Bederson 評分比較與假手術(shù)組比較，pMCAO 模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損，評分范圍在2 ～ 3 分( P ＜0． 01) 。與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 和維腦路通組( 50mg /kg) 大鼠神經(jīng)功能評分有不同程度的下降;七十味低劑量組( 166mg /kg) 與模型組神經(jīng)功能評分無統(tǒng)計學(xué)差異。七十味高劑量組神經(jīng)功能評分低于維腦路通組.

　　2.2 各組Ｒotarod test 測評比較與假手術(shù)組比較，pMCAO 模型組大鼠表現(xiàn)出較短的轉(zhuǎn)棒時間。與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 、低劑量組( 166mg /kg) 和維腦路通組( 50mg /kg) 大鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期明顯增加。七十味高劑量組大鼠表現(xiàn)出較長的轉(zhuǎn)棒潛伏期，顯著高于維腦路通組( P ＜ 0.01)

　　2.3 各組血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶( NSE) 、S-100β 蛋白水平比較與假手術(shù)組比較，pMCAO 模型組大鼠NSE、S-100β蛋白水平均顯著升高。與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 、低劑量組( 166mg /kg) 和維腦路通組( 50mg /kg)大鼠NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降。七十味高劑量組大鼠NSE、S-100β 蛋白水平顯著低于維腦路通組。

　　3 討論缺血性腦卒中通常是主要腦動脈或其分支的血栓形成或栓塞所致，最常發(fā)生的部位是大腦中動脈，目前在基礎(chǔ)研究中腦缺血動物模型有許多種，其中線栓法造成大腦中動脈阻塞( middle cerebral artery occlusion，MCAO) 被公認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦梗死動物模型［4］，其中永久性大腦中動脈阻塞模型( permanentmiddle cerebral artery occlusion，pMCAO) 因其不開顱，梗塞灶的大小、位置恒定，缺血效果穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點被入選為本次研究的實驗對象。由于鼠腦結(jié)構(gòu)具有不對稱性，左側(cè)迷走神經(jīng)直接分布于心臟，術(shù)中損傷對于心臟功能、血壓等影響較大，為減少腦外因素的影響，本次實驗選擇右側(cè)大腦中動脈永久性阻塞。

　　國際腦卒中治療臨床前研究指南( STAIＲ) 指出，在腦缺血藥物研究中包括行為學(xué)在內(nèi)多重指標(biāo)綜合評價，并強調(diào)行為學(xué)評價的重要性。在腦卒中實驗研究中，神經(jīng)功能損傷評分不僅是模型成功的標(biāo)志，而且也反映了腦缺血的嚴(yán)重程度。Bederson評分因其操作簡單，目前在國內(nèi)應(yīng)用比較廣泛，但其較為主觀，缺乏定量性，具有一定的局限性。本次實驗又增加了定量神經(jīng)運動功能檢測( Ｒotarod test) ，客觀定量的評價動物的運動協(xié)調(diào)功能。兩種神經(jīng)行為學(xué)( Bederson 評分和Ｒotarod test) 的結(jié)合能更準(zhǔn)確的反映局灶性腦缺血造成的神經(jīng)功能障礙程度。Bederson評分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，pMCAO 模型組出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)功能缺損，評分范圍在2 ～ 3 分，說明pMCAO 大鼠模型制作成功; 七十味高劑量組( 664mg /kg) 與pMCAO 模型組相比可明顯降低大鼠神經(jīng)功能評分; Ｒotarod test 測評結(jié)果表明，七十味高劑量組( 664mg /kg) 表現(xiàn)出較長的轉(zhuǎn)棒潛伏期，顯著高于pMCAO 模型組和維腦路通組( 50mg /kg) 。本實驗結(jié)果提示，七十味珍珠丸能夠減輕大鼠pMCAO 后神經(jīng)功能缺損程度，改善運動功能障礙，具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

　　神經(jīng)元特異性烯醇化酶( Neuron-specific enolase，NSE) 是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，屬于糖酵解同工酶二聚體，特異性存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞漿中，當(dāng)神經(jīng)元損傷或壞死后，NSE從細(xì)胞內(nèi)溢出，進(jìn)入腦脊液和血液中，因腦膠質(zhì)細(xì)胞和其他腦神經(jīng)組織不含NSE，故NSE 是是唯一反映神經(jīng)元損傷的特異性生化指標(biāo)。S-100β 蛋白是一種小分子酸性的鈣離子結(jié)合蛋白，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的雪旺細(xì)胞，是神經(jīng)膠質(zhì)的標(biāo)記蛋白。正常條件下不能通過血腦屏障( BBB) ，當(dāng)顱腦損傷血腦屏障受到破壞時，S-100β 通過破損的血腦屏障進(jìn)入血液中，血清中S-100β 的增高意味著神經(jīng)損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的破壞和星形細(xì)胞反應(yīng)狀況，故S-100β 蛋白是反映腦損傷程度和預(yù)后的一個敏感指標(biāo)［5］。與假手術(shù)組比較，pMCAO 模型組大鼠NSE、S-100β 蛋白水平均顯著升高( P ＜ 0． 01) ，說明腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)性死亡或繼發(fā)性功能損傷引起了血清NSE 和S-100β 蛋白出現(xiàn)持續(xù)升高或繼發(fā)性升高。與pMCAO 模型組比較，七十味高劑量組( 664mg /kg) 、低劑量組( 166mg /kg) 中NSE 和S-100β 蛋白水平都有不同程度的下降，說明七十味珍珠丸可降低大鼠pMCAO后血清NSE、S-100β 蛋白水平，減輕腦缺血后神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。

　　上述實驗結(jié)果提示，七十味珍珠丸可有效降低pMCAO 大鼠血清中NSE、S-100β 蛋白水平，從而減輕神經(jīng)功能缺損程度，改善運動功能障礙，可見其具有較好的神經(jīng)保護(hù)作用，效應(yīng)細(xì)胞既在神經(jīng)元，又在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

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