70年以來國內外一系列研究證明靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss。ex Fr。)Karst。] 對動物移植性腫瘤具有抑制作用，可使瘤重減輕，生存時間延長。并認為靈芝多糖可能是靈芝抗腫瘤作用的重要有效成份[1]。然而，靈芝的抗腫瘤作用是如何產生的？靈芝是直接殺死腫瘤細胞，還是像一些學者推測的那樣：靈芝是通過機體內部的抗腫瘤機制間接殺死腫瘤細胞，這些均是目前學術界關注的焦點。為此，我們采用體內外抗腫瘤實驗方法和細胞分子生物學技術以及血清藥理學方法探討了靈芝的抗腫瘤作用及其機制。

 

　　1 靈芝的體內抗腫瘤作用　　給Blab/c 小鼠皮下接種肉瘤S-180后，灌胃靈芝提取物（GLE）5、10、20g（生藥）/kg，共10d，可顯著抑制S-180肉瘤生長，其抑瘤率分別為22。77%、41。58%和60。89%[2]。同樣，灌胃靈芝多糖B（GL-B）50、100、200mg/kg ，共10d，也可抑制Balb/c小鼠S-180生長，抑瘤率分別為27。70%、55。83%和66。70%。GL-B與環磷酰胺（Cyclophosphamide,Cy）并用還能增強后者的抗腫瘤作用[3]。我們還發現靈芝菌絲體多糖50、100mg/kg 可顯著抑制Balb/c 小鼠和昆明種小鼠移植性肉瘤S-180 生長，其抑瘤率分別為52。86%、78。10%和37。78%、61。79%。以上結果證明，靈芝及其所含多糖在小鼠體內具有抗腫瘤作用。

 

　　2 靈芝在體外對腫瘤細胞的作用　　靈芝在體外對腫瘤細胞是否有直接抑制作用？我們將濃度為50、100、200mg（生藥）/mL 的GLE加至體外培養的S-180 細胞培養基中， 用MTT法檢測腫瘤細胞增殖活性，結果GLE對S-180細胞的增殖并無直接抑制作用（見表1）[3]。同樣，將GL-B（50～200mg/L）直接加入到人白血病細胞（HL-60）培養基中，GL-B對HL-60細胞的增殖亦無顯著抑制作用。靈芝菌絲體多糖（5。9～750mg/L）對HL-60細胞在體外生長也無抑制作用[3]。這些結果指出，靈芝及其所含多糖并不能直接抑制或殺死腫瘤細胞，即它們并非細胞毒類抗腫瘤藥。靈芝雖不能直接殺死腫瘤細胞，但它是否能像一些抗腫瘤藥那樣誘導腫瘤細胞凋亡？細胞凋亡（apoptosis）是一種細胞主動死亡過程，目前發現，一些抗腫瘤藥如烷化劑、抗代謝藥、抗激素藥等均能通過誘導對其敏感的腫瘤細胞株的凋亡而實現抗腫瘤作用。靈芝是否能誘導腫瘤細胞凋亡？我們采用瓊脂糖凝膠電泳法和流式細胞儀檢測法觀察靈芝對體外培養的腫瘤細胞凋亡的影響，結果發現：當濃度為50～100mg（生藥）/mL 時， GLE不能直接誘導體外培養的S-180細胞凋亡（表1）。GL-B（50～200mg/L）亦不能直接誘導HL-60細胞凋亡[2，3]。而靈芝菌絲體多糖即使濃度高達600mg/L ， 也不能直接誘導HL-60細胞凋亡[4]。以上結果指出靈芝及其所含多糖既不能直接抑制或殺死腫瘤細胞，又不能直接誘導腫瘤細胞凋亡。靈芝在體內的抗腫瘤作用又是如何產生的呢？

 

　　3 靈芝抗腫瘤作用的血清藥理學研究　　血清藥理學試驗是指給試驗動物灌服中藥后，取服藥動物的血清，即含藥血清代替中藥進行體外試驗的方法。含藥血清中可能含有所服中藥或其活性代謝產物，也可能含有在中藥作用下產生的內源性活性物質， 并因此而產生藥理作用。為了探討靈芝及其所含多糖在體內的抗腫瘤作用機制， 我們采用了血清藥理學方法進行了以下研究：給小鼠灌胃GLE5、10、20g（生藥）/kg，共10d， 最后一次給藥后1h， 取血，無菌分離血清，經56℃，30min滅活處理后，并經微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存備用。將此含GLE血清加至體外培養的S-180細胞中，可明顯抑制S-180細胞生長并可誘導S-180細胞凋亡（見表1）[2]。與以上結果相似，經小鼠灌胃不同劑量的GL-B后，取出小鼠的血清（含GL-B血清），并觀察此血清在體外對HL-6細胞生長的影響。結果可見含GL-B血清可顯著抑制HL-60 細胞增殖并明顯地誘導HL-60細胞凋亡[3]。結果提示，小鼠灌服GLE或GL-B后血清中可能出現了一種有抗 腫瘤活性的物質。究竟是什么物質？我們又分別采用生物法和ELISA方法，檢測GLE血清中TNFa的活性和IFNg的含量。TNFa活性測定用L929細胞結晶紫染料攝入法。TNFa可使小鼠成纖維細胞株L929細胞死亡，用結晶紫染料可使活細胞著色，加入細胞裂解劑SDS， 可使染料從細胞內脫出顯色，通過酶標儀直接進行比色測定，反映細胞的存活狀態，從而間接反映TNFa的活性，OD值越小反映TNFa的活性越大。IFNg的測定采用小鼠IFNg ELISA 試劑盒測定，該法可準確定量。結果顯示，GLE5、10、20g（生藥）/kg或GL-B 50，100，200mg/kg灌胃小鼠血清中TNFa的活性隨GLE或GL-B的劑量增加而增強，并表現出明顯的劑量依賴關系[2，3]。相同劑量處理小鼠血清中IFNg的含量亦顯著增加（見表2、表3）。已知TNFa和IFNg對腫瘤細胞均具有細胞毒作用，TNFa在體外可誘導多種不同來源的腫瘤細胞凋亡，因此，含GLE或GL-B血清在體外抑制腫瘤細胞生長和促進腫瘤細胞凋亡的作用，至少與其中所含TNFa和IFNg有關，而后二者是在GLE或GL-B作用下，在體內生成的。而IFNg還可與TNFa協同作用使后者誘導腫瘤細胞凋亡的作用增強。表1　GLE和含GLE血青對S-180細胞增殖和凋亡的影響。

 

      4 靈芝與巨噬細胞、脾細胞共同培養上清液對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響　　為了進一步探討靈芝多糖的抗腫瘤作用機制。我們在小鼠腹腔巨噬細胞培養中，加入濃度為50、100、200mg/L 的GL-B共同培養24h，然后取共培養上清液（GL-B-PM-CM）加至HL-60細胞培養基中，可顯著抑制HL-60 細胞增殖和促其凋亡[2，3]。　　這一結果提示，在GL-B作用下，共培養上清液中出現一種能抑制HL-60細胞增殖并促其凋亡的活性物質，是否就是前述試驗中的TNFa？我們進一步用生物法檢測培養上清中TNFa的含量。結果發現，GL-B確有誘導小鼠腹腔巨噬細胞產生TNFa的作用， 并呈現出明顯的量效關系。同上劑量的GL-B與小鼠脾細胞共同培養上清（GL-B-S-CM）亦能顯著抑制HL-60細胞增殖并促進其凋亡，這一作用也和GL-B與小鼠脾細胞共同培養上清中INFg含量增加一致。同樣，濃度為12。5、50、200mg/L的靈芝菌絲體多糖與小鼠腹腔巨噬細胞共培養24h，共培養上清液可顯著抑制HL-60細胞增殖，并促其凋亡。與此同時，上清液中TNFa的分泌亦明顯增加[5]。Wang等（1997）將靈芝子實體多糖PS-G直接加入白血病細胞株HL-60和V937細胞培養中，既不能抑制此二細胞株增殖，也不能誘導此二細胞株凋亡。但在此二細胞培養中，加入20%（vol/vol）PS-G與人外周血單核細胞培養液則可顯著抑制此二細胞增殖，并促其凋亡。進一步研究還證明，在健康人外周血單核細胞或T淋巴細胞培養中加入PS-G，可明顯促進巨噬細胞生成IL-1b、TNFa和IL-6以及T淋巴細胞生成IFNg[6]，這些結果均說明靈芝多糖確能直接作用于巨噬細胞和T淋巴細胞，促其產生TNFa和IFNg等細胞因子，進一步抑制腫瘤細胞或促其凋亡。

 

　　5 靈芝對巨噬細胞TNFa mRNA 和脾細胞 IFNg mRNA 表達的影響　　為了進一步在分子水平觀察GL-B促進TNFa生成的機制，我們進一步研究了GL-B對此二細胞因子mRNA 表達的影響，即在小鼠巨噬細胞或脾細胞培養基中加入不同濃度的GL-B，培養1～2d后用TRIZOL試劑提取細胞內總RNA，加入相應的細胞因子或內對照b-actin引物和RT-PCR反應體系，置PCR儀中擴增，瓊脂糖電泳分析擴增產物，并用圖像分析儀對擴增的泳帶進行輝度分析。結果表明GL-B可顯著促進小鼠腹腔巨噬細胞TNFa mRNA和脾細胞IFNg mRNA的表達水平（見表4）。在體內給藥的條件下，靈芝是否也能促進這些細胞因子的mRNA 表達？我們給小鼠灌胃GLE5g（生藥）/kg、10g（生藥）/kg、20g（生藥）/kg，共10d，取小鼠的巨噬細胞或脾細胞，按前法測TNFa mRNA或IFNg mRNA表達。結果可見，給小鼠灌胃GLE可顯著增加小鼠巨噬細胞TNFa mRNA表達和脾細胞IFNg mRNA表達（見表5）[7，8]。　　

 

      綜上所述，靈芝在體內對小鼠移植性腫瘤有抗腫瘤作用，但對體外培養的腫瘤細胞無直接抑制作用。加之，靈芝能增強機體的免疫功能，如增強小鼠遲發型過敏反應、促進淋巴細胞增殖反應、增強細胞毒T細胞的功能、增強巨噬細胞的吞噬功能、促進白介素1（IL-1）、白介素2（IL-2）和白介素6（IL-6）的生成等[1]，故推測靈芝的抗腫瘤作用可能是由機體免疫系統介導的。我們的研究證明：靈芝及其所含多糖在體內可直接作用于巨噬細胞和脾細胞，促進TNFa mRNA和IFN g mRNA 表達，增加TNFa和IFNg的生成， 并因此而殺死腫瘤細胞。